Brain mechanism involved in estrogen feedback to control animal reproduction

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18H03973
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 束村 博子 名古屋大学, 生命農学研究科, 教授 (00212051)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 松田 二子 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 准教授 (10608855) ; 大蔵 聡 名古屋大学, 生命農学研究科, 教授 (20263163) ; 平林 真澄 生理学研究所, 行動・代謝分子解析センター, 准教授 (20353435) ; 上野山 賀久 名古屋大学, 生命農学研究科, 准教授 (70324382)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: キスペプチン / GPR54 / GnRH / メタスチン / エストロゲン

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、哺乳類メスにおける「卵胞発育」と「排卵」を制御する弓状核および前腹側室周囲核（AVPV、種によっては視索前野）のキスペプチンニューロンへのエストロゲンのフィードバック機構に着目し、卵胞発育を支配する負のフィードバック、および排卵を支配する正のフィードバックによる性腺刺激ホルモン分泌放出ホルモン（GnRH）/性腺刺激ホルモン分泌制御の分子メカニズムの解明とその応用の検証を目的とする。本年度の研究により、以下の成果を得た。
キスペプチン遺伝子（Kiss1）-floxedマウス・ラットを作成し、エストロゲンの負のフィードバック部位である弓状核特異的にKiss1のノックアウト（KO）を行い、同キスペプチンニューロンが卵胞発育中枢であることを証明した。また、ヒストン修飾蛋白RBBP7がKiss1発現に促進的であることを明らかにした。また、キスペプチンニューロンに発現する受容体探索により得たGPCR候補であるGPR101のリガンドGnRH(1-5)が、同ニューロンに作用してGnRH/LH分泌を促進することを明らかにした。また、低栄養モデルラットにおいて、エストロゲン依存性に室傍核ダイノルフィン（Dyn）ニューロンが活性化し、弓状核キスペプチンニューロンに発現するDyn受容体を介してLHパルスを抑制することを証明した。さらに、反芻家畜モデルのヤギを用いて、脳内へのニューロキニンB投与が弓状核キスペプチンニューロンに作用し、GnRH/LHパルスを促進すること、また脳内へのカルシトニン受容体リガンド（アミリン）の投与がGnRH/LHパルスジェネレータ（弓状核キスペプチンニューロン）の活動を短期的には促進、長期的には抑制することを明らかにした。加えて、ヤギ弓状核および視索前野キスペプチンニューロン由来不死化細胞株を確立し、今後のin vitro実験に資する結果を得た。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

本年度の研究実施により、17報の原著論文および2報の総説・著書（全て査読有）を発表し、研究計画よりも極めて大きな進展があった。以下が進捗の概要である。
コンディショナルKiss1 KOマウス・ラットによる卵胞発育中の証明： Kiss1-floxedマウス・ラットを作成し、弓状核特異的にKiss1のKOを行い、弓状核KISSニューロンが卵胞発育中枢であることを証明した（Ikegamiら, 2020; Minabeら, 2020; Nagaeら, 2021）。生殖中枢キスペプチン（KISS）ニューロンにおけるRBBP7の役割：KISSニューロンにおいて、ヒストン修飾蛋白RBBP7がKiss1発現に促進的に作用することを示した（Horihataら, 2020）。生殖中枢KISSニューロンに発現する受容体の制御機序：ラットKISSニューロンに発現するGPR101のリガンドGnRH(1-5)の脳内投与が、LH分泌を促進することを明らかにした（Iedaら, 2020）。低栄養によるLHパルスの抑制が室傍核ダイノルフィンニューロンに仲介されることを証明した（Tsuchidaら, 2020）。ヤギ（反芻家畜モデル）を用いたキスペプチンニューロンに発現する受容体の役割：ヤギ脳内へのカルシトニン受容体リガンドの投与がGnRH/LHパルスジェネレータの活動を短期的には促進、長期的には抑制することを発見した（Kitagawaら, 2020）。またニューロキニンBが、GnRHパルスを促進的に制御することを証明した（Sasakiら , 2020）。ヤギキスペプチンニューロン由来の不死化細胞株の樹立：ヤギ弓状核および視索前野KISSニューロン由来不死化細胞株を確立した（Suetomiら, 2020; Ohshimoら, 2020）。

Strategy for Future Research Activity

本年度は、本研究課題の推進で蓄積した成果を多数の論文として公表できた。今後は、特に弓状核キスペプチンニューロン (卵胞発育中枢)、およびAVPVキスペプチンニューロン (排卵中枢) において、特異的に発現することを確認したが、機能が未解明である他のエピジェネティック制御候補因子やエストロゲン受容体共役コファクター等の機能解析を実施する。具体的には、本研究で得られた不死化キスペプチンニューロン株を用いて、候補因子のKiss1遺伝子発現への効果を検証する予定である。また、上記２群のキスペプチンニューロンに発現する機能が未解明の受容体（GPCRなど）について、候補リガンドのキスペプチン放出効果を、in vitroで細胞内カルシウム濃度への効果を確認し検証する。さらに、候補リガンドをin vivoにて、ラットやヤギ脳内に投与しGnRH分泌の指標であるLH分泌への効果を検証するとともに、候補因子のヤギ弓状核キスペプチンニューロン（GnRHパルスジェネレータ）活動への効果を検証する予定である。加えて、本研究の実施により、キスペプチンニューロンを常時可視化した遺伝子改変ラットの作製に成功し、エストロゲンによってKiss１発現が抑制された弓状核キスペプチンニューロンや、エストロゲンがないため同定できなかったAVPVの同ニューロンを可視化する事が可能となったことから、エストロゲンの有無によってキスペプチンニューロン内で発現が増減する遺伝子を解析し、得られた候補因子が、弓状核やAVPVのキスペプチンニューロンに対するエストロゲンフィードバック効果を仲介するかを探索する予定である。さらに、ラットモデルで得られたKiss1遺伝子発現やキスペプチン分泌を制御する候補因子に関する知見を、ヤギ、ウシに応用できるかを検証する予定である。

Research Products

• [Journal Article] Direct evidence that KNDy neurons maintain gonadotropin pulses and folliculogenesis as the GnRH pulse generator (2021)
  • Author(s): Nagae Mayuko、Uenoyama Yoshihisa、Okamoto Saki、Tsuchida Hitomi、Ikegami Kana、Goto Teppei、Majarune Sutisa、Nakamura Sho、Sanbo Makoto、Hirabayashi Masumi、Kobayashi Kenta、Inoue Naoko、Tsukamura Hiroko
  • Journal Title: Proceedings of the National Academy of Sciences Volume: 118 Pages: e2009156118
  • DOI: 10.1073/pnas.2009156118
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Estrogen increases KISS1 expression in newly generated immortalized KISS1-expressing cell line derived from goat preoptic area. (2021)
  • Author(s): Oshimo, Y., Munetomo, A., Magata, F., Suetomi, Y., Sonoda, S., Takeuchi, Y., Tsukamura, H., Ohkura, S., Matsuda, F.
  • Journal Title: J Reprod Dev. Volume: 67(1) Pages: 15-23
  • DOI: 10.1262/jrd.2020-053
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Reduction of arcuate kappa-opioid receptor-expressing cells increased luteinizing hormone pulse frequency in female rats. (2021)
  • Author(s): Dai, M., Nakamura, S., Takahashi, C., Sato, M., Munetomo, A., Magata, F., Uenoyama, Y., Tsukamura, H., Matsuda, F.
  • Journal Title: Endocrine Journal Volume: - Pages: -
  • DOI: 10.1507/endocrj.EJ20-0832.
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] The neuroendocrine regulation of the mammalian production. (2021)
  • Author(s): Tsukamura, H.
  • Journal Title: General and Comparative Endocrinology Volume: - Pages: -
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Effect of diet-induced obesity on Kiss1/Tac3/Pdyn gene expressions in the arcuate nucleus and luteinizing hormone secretion in sex hormone-primed male and female rats. (2021)
  • Author(s): Minabe, S., Iwata, K., Tsuchida, H., Tsukamura, H., Ozawa, H.
  • Journal Title: Peptides Volume: - Pages: -
  • DOI: 10.1016/j.peptides.2021.170546.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Testosterone regulation on quiescin sulfhydryl oxidase 2 synthes. (2021)
  • Author(s): Wang, T.-E., Minabe, S., Matsuda, F., Li, S.-H., Tsukamura, H., Maeda, K.-I., Smith, L., O'Hara, L., Gadella, B. M., Tsai, P.-S.
  • Journal Title: Reproduction Volume: - Pages: -
  • DOI: 10.1530/REP-20-0629
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Retinoblastoma binding protein 7 is involved in Kiss1 mRNA upregulation in rodents. (2020)
  • Author(s): Horihata K, Inoue N, Uenoyama Y, Maeda KI, Tsukamura H.
  • Journal Title: J Reprod Dev. Volume: 66(2) Pages: 125 - 133
  • DOI: 10.1262/jrd.2019-149. Epub 2020 Jan 19.PMID: 31956172
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Seasonal changes in the reproductive performance in local cows receiving artificial insemination in the Pursat province of Cambodia. (2020)
  • Author(s): Bengthay Tep, Yasuhiro Morita, Shuichi Matsuyama, Satoshi Ohkura, Naoko Inoue, Hiroko Tsukamura, Yoshihisa Uenoyama, Vutha Pheng.
  • Journal Title: Asian-Australasian Journal of Animal Sciences Volume: 33(12) Pages: 1922-1929
  • DOI: 10.5713/ajas.19.0893
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] GnRH(1-5), a metabolite of gonadotropin-releasing hormone, enhances luteinizing hormone release via activation of kisspeptin neurons in female rats. (2020)
  • Author(s): Ieda N, Assadullah, Minabe S, Ikegami K, Watanabe Y, Sugimoto Y, Sugimoto A, Kawai N, Ishii H, Inoue N, Uenoyama Y, Tsukamura H
  • Journal Title: Endocrine J Volume: 67(4) Pages: 409 - 418
  • DOI: 10.1507/endocrj.EJ19-0444
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Establishment of immortalised cell lines derived from female Shiba goat KNDy and GnRH neurones (2020)
  • Author(s): Suetomi Y, Tatebayashi R, Sonoda S, Munetomo A, Matsuyama S, Inoue N, Uenoyama Y, Takeuchi Y,Tsukamura H, Ohkura S, Matsuda F.
  • Journal Title: J Neuroendocrinol. Volume: 32(6) Pages: 12857
  • DOI: 10.1111/jne.12857
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Inducible Kiss1 knockdown in the hypothalamic arcuate nucleus suppressed pulsatile secretion of luteinizing hormone in male mice. (2020)
  • Author(s): Minabe S, Nakamura S, Fukushima E, Sato M, Ikegami K, Goto T, Sanbo M, Hirabayashi M, Tomikawa J, Imamura T, Inoue N, Uenoyama Y, Tsukamura H, Maeda KI, Matsuda F.
  • Journal Title: J Reprod Dev Volume: 66(4) Pages: 369 - 375
  • DOI: 10.1262/jrd.2019-164
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Peripheral administration of SB223412, a selective neurokinin-3 receptor antagonist, suppresses pulsatile luteinizing hormone secretion by acting on the gonadotropin-releasing hormone pulse generator in estrogen-treated ovariectomized female goats (2020)
  • Author(s): Sasaki T, Sonoda T, Tatebayashi R, Kitagawa Y, Oishi S, Yamamoto K, Fujii N, Inoue N, Uenoyama Y, Tsukamura H, Maeda KI, Matsuda F, Morita Y, Matsuyama S, Ohkura S.
  • Journal Title: J Reprod Dev Volume: 66(4) Pages: 351 - 357
  • DOI: 10.1262/jrd.2019-145
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Conditional kisspeptin neuron-specific Kiss1 knockout with newly generated Kiss1-floxed and Kiss1-Cre mice replicates a hypogonadal phenotype of global Kiss1 knockout mice. (2020)
  • Author(s): Ikegami K, Goto T, Nakamura S, Watanabe Y, Sugimoto A, Majarune S, Horihata K, Nagae M, Tomikawa J, Imamura T, Sanbo M, Hirabayashi M, Inoue N, Maeda KI, Tsukamura H, Uenoyama Y.
  • Journal Title: J Reprod Dev Volume: 66(4) Pages: 359 - 367
  • DOI: 10.1262/jrd.2020-026
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Testosterone supplementation rescues spermatogenesis and in vitro fertilizing ability of sperm in Kiss1 knockout mice. (2020)
  • Author(s): T. Goto, M. Hirabayashi, Y. Watanabe, M. Sanbo, K. Tomita, N. Inoue, H. Tsukamura, Y. Uenoyama.
  • Journal Title: Endocrinology Volume: 161(9) Pages: 1-11
  • DOI: 10.1210/endocr/bqaa092
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Mating-induced increase in Kiss1 mRNA expression in the anteroventral periventricular nucleus prior to an increase in LH and testosterone release in male rats. (2020)
  • Author(s): Youki Watanabe, Kana Ikegami, Sho Nakamura, Yoshihisa Uenoyama, Hitoshi Ozawa, Kei-Ichiro Maeda, Hiroko Tsukamura, Naoko Inoue
  • Journal Title: J Reprod Dev Volume: 66(6) Pages: 579-586
  • DOI: 10.1262/jrd.2020-067
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Facilitatory and inhibitory role of central amylin administration in the regulation of the gonadotropin-releasing hormone pulse generator activity in goats . (2020)
  • Author(s): Yuri Kitagawa, Takuya Sasaki, Reika Suzumura, Ai Morishima, Ryoki Tatebayashi, Assadullah, Nahoko Ieda, Yasuhiro Morita, Shuichi Matsuyama, Naoko Inoue, Yoshihisa Uenoyama, Hiroko Tsukamura, Satoshi Ohkura.
  • Journal Title: Neuroscience Letters Volume: 736 Pages: 135276 - 135276
  • DOI: 10.1016/j.neulet.2020.135276.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Paraventricular dynorphin A neurons mediate LH pulse suppression induced by hindbrain glucoprivation in female rats. (2020)
  • Author(s): Hitomi Tsuchida, Parvin Mostari, Koki Yamada, Sae Miyazaki, Yuki Enomoto, Naoko Inoue, Yoshihisa Uenoyama, Hiroko Tsukamura.
  • Journal Title: Endocrinology Volume: 161(11) Pages: 1-18
  • DOI: 10.1210/endocr/bqaa161
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Establishment of long-term chronic recording technique of in vivo ovarian parenchymal temperature in Japanese Black cows. (2020)
  • Author(s): Morita, Y., Ozaki, R., Mukaiyama, A., Sasaki, T., Tatebayashi, R., Morishima, A., Kitagawa, Y., Suzumura, R., Abe, R., Tsukamura, H., Matsuyama, S. and Ohkura, S.
  • Journal Title: Journal of Reproduction and Development Volume: 66(3) Pages: 271-275
  • DOI: 10.1262/jrd.2019-097
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Generation of Genetically Modified Rats for Analysis of Neural Mechanism Involved in GnRH Pulse Generation. (2021)
  • Author(s): Mayuko Nagae, Toshihiro Kobayashi, Makoto Sanbo, Masumi Hirabayashi, Naoko Inoue, Hiroko Tsukamura, Yoshihisa Uenoyama
  • Organizer: 2020年度GTR成果報告会
• [Presentation] 低栄養による生殖機能抑制は室傍核ダイノルフィンニューロンによる弓状核キスペプチンニューロンの抑制によって仲介される (2020)
  • Author(s): 土田 仁美，井上 直子，上野山 賀久，束村 博子
  • Organizer: 第113回日本繁殖生物学会
• [Presentation] 室傍核ダイノルフィンニューロンがグルコース利用阻害による生殖機能抑制を仲介する (2020)
  • Author(s): 土田 仁美，井上 直子，上野山 賀久，束村 博子
  • Organizer: 第25回日本生殖内分泌学会
• [Presentation] アデノ随伴ウイルスベクター法を介した効率的なTfap2c-T2A-tdTomatoノックインラット作製とその発現解析 (2020)
  • Author(s): 長江麻佑子、及川真実、水野直彬、岩月研祐、三宝誠、中内啓光、平林真澄、小林俊寛
  • Organizer: 第67回日本実験動物学会総会
• [Presentation] 遺伝子改変ラットを用いた卵胞発育中枢の同定 (2020)
  • Author(s): 長江麻佑子、上野山賀久、井上直子、小林憲太、平林真澄、束村博子
  • Organizer: 第10回名古屋大学医学系研究科・生理学研究所合同シンポジウム
• [Presentation] ATP-プリン受容体シグナリングによるAVPVキスペプチンニューロン由来不死化細胞株活性化の検討 (2020)
  • Author(s): 土肥由莉、上野山賀久、束村博子、井上直子
  • Organizer: 第113回日本繁殖生物学会
• [Presentation] Kiss1発現を制御するエストロジェン受容体αコリプレッサーの探索 (2020)
  • Author(s): 宮崎紗衣、井上直子、束村博子、上野山賀久
  • Organizer: 第113回日本繁殖生物学会
• [Presentation] ATP-プリン受容体シグナリングによるLHサージ制御機構 ～ATPはキスペプチンニューロン不死化細胞のCa2+を上昇させる～ (2020)
  • Author(s): 土肥由莉、大塚裕記、上野山賀久、束村博子、井上直子
  • Organizer: 東海畜産学会
• [Presentation] 弓状核Kiss1発現を制御するエストロジェン受容体αコリプレッサーの探索 (2020)
  • Author(s): 宮崎紗衣、井上直子、束村博子、上野山賀久
  • Organizer: 東海畜産学会
• [Presentation] 弓状核特異的Kiss1レスキュー/ノックアウトラットを用いたGnRHパルスジェネレーターの同定 (2020)
  • Author(s): 長江麻佑子、上野山賀久、岡本沙季、土田仁美、池上花奈、後藤哲平、三宝誠、平林真澄、小林憲太、井上直子、束村博子
  • Organizer: 第25回日本生殖内分泌学会
• [Book] 「繁殖生物学改訂版」日本繁殖生物学会編 (2020)
  • Author(s): 束村博子
  • Total Pages: 179-201
  • Publisher: インターズー