2019 Fiscal Year Annual Research Report
Study of the program underlying the mammalian complex brain formation
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18H04003
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
松崎 文雄 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, チームリーダー (10173824)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 神経幹細胞 / 複雑脳 / 脳回 / 高次能 / 細胞系譜 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
short RGは我々が同定した神経幹細胞のひとつ。幹細胞の維持に必須なNotchの下流に位置する自己複製に必須な転写因子であるHes1を発現するが、そのことはNotchの活性がaRGの姉妹細胞でも高いことを示している。このsRGは脳室内で２回ほど自己複製したのち、proneural遺伝子のAscl1を発現することにより、Hes１の活性を低下させ、中間前駆細胞の連続した対称分裂モードに入ることがタイムラプス解析により判明した。Ascl1の遺伝子破壊により、形成される中間前駆細胞は分裂回数を大きく減らすことが明らかになった。したがって、Notchシグナルによる自己複製能はsRGまで維持されるがそれから後Ascl1発現中間前駆細胞の状態にシフトしながらも、増殖能ををある程度維持し、神経細胞数を増幅させる大きな要因となることが判明した。
今年度から本格的に細胞系譜の解析に入った。Barclock法はかなり先進的な技術であるので、マウスをモデルとしてテストすることになった。まず、barcodeとbarclock modeleを合わせた長さが1000bp程度になるおで、それを1base単位の正確さで読み取るために、PacBioという方法を採用することになった、この方法は高価なため、この研究費ではカバーできないため、新学術領域「先進ゲノム支援」に応募し、承諾を得て行った。その結果、単一細胞（barcode）のcloneが非常に多く、その原因を探ったところ、cDNAのPCR増幅の際、barclockを導入するplasmidが増幅されるprimerを使用していることがわかったため、次回にlarge scaleの実験を行う際は、genomeに挿入される際に、方向の逆転をちゃんと検知するよう、promoter上にあるpromoterを選んで使うことになった。また、knock-inの効率が極めて悪いので、次回は別のknockin siteを用いるか、creを用いない方法（つまり、分化した細胞では時計が止まらず、ずっとbarclockにはmutationが入り続ける）を採用することにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
今年度から本格的に細胞系譜の解析に入った。Barclock法はかなり先進的な技術であるので、マウスをモデルとしてテストすることになった。まず、barcodeとbarclock modeleを合わせた長さが1000bp程度になるおで、それを1base単位の正確さで読み取るために、PacBioという方法を採用することになった、この方法は高価なため、この研究費ではカバーできないため、新学術領域「先進ゲノム支援」に応募し、承諾を得て行った。その結果、単一細胞（barcode）のcloneが非常に多く、その原因を探ったところ、cDNAのPCR増幅の際、barclockを導入するplasmidが増幅されるprimerを使用していることがわかったため、次回にlarge scaleの実験を行う際は、genomeに挿入される際に、方向の逆転をちゃんと検知するよう、promoter上にあるpromoterを選んで使うことになった。また、knock-inの効率が極めて悪いので、次回は別のknockin siteを用いるか、creを用いない方法（つまり、分化した細胞では時計が止まらず、ずっとbarclockにはmutationが入り続ける）を採用することにした。
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| Strategy for Future Research Activity |
「先進ゲノム支援」というすばらしいシステムがあり、そのサポートを得られる今年度前半中に、できるだけフェレットの実験系に移りたい。そのためには、マウスできちんと細胞系譜が終えることを証明する。in utero electroporation法でbarclock systemをマウスの胎児に入れ、そこからprimary cultureを作り、顕微鏡でmonitorをしながらsingle cloneを増やす。clone内の細胞はGFPを発現しているので、10~20個ののcloneサイズになったとき、ひとつひとつの細胞からmRNAをとり、barclock配列を決定し系譜を描く、この系譜とimagingによる直接観察の結果が一致しているかどうかを検討する。
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