2019 Fiscal Year Annual Research Report
Metabolism-based dissection of tumor microenvironment infiltrated by immune cells
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18H04033
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
鵜殿 平一郎 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 教授 (50260659)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
城口 克之 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, チームリーダー (00454059)
菱木 貴子 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (10338022)
久保 亜紀子 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 助教 (50455573)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | Nrf2 / mTORC1 / p62 / 解糖系 / Glut-1 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
腫瘍が退縮する際のCD8TILsとがん細胞の代謝バランス変動と、シグナル分子変動をさらに解析するために以下のように実験を行った。
A)メトホルミンあるいは抗PD-1抗体との併用における腫瘍免疫応答に際し、Nrf2 コンデイショナルKOマウス及びp62コンデイショナルKOマウスにおけるCD8TILsのmTORC1活性化の有無、オートファジーとの関係、解糖系（Glut-1発現）との関係につき、明らかにした。上記２種類の遺伝子改変マウスでは、CD8TILsにおいてmTORC1活性化の消失（pS6リン低下）、オートファジー機能の消失（LC3B発現低下）、細胞増殖の消失（Ki67発現低下）が認められた。また、Glut-1の発現は、p62KOのCD8TILsにおいてのみ観察された。
B）腫瘍とそれを取り巻く細胞の代謝・レドックスバランスの解析。In situ 代謝解析を用いた腫瘍微小環境のレドックスおよび代謝状態の解析で本番の実験を行う。マウス腫瘍片、リンパ節、脾臓、肝臓の試料は岡山大学で作成しスライド切片にした後に、研究分担者の久保と菱木（慶應義塾大学）に送付して質量分析解析とイメージングを行った。各種代謝産物（解糖系、TCAサイクル、酸化的リン酸化）およびメトホルミン濃度を測定することができた。
C）RNAseqによる遺伝子発現解析とそれを基にしたトランスクリプトーム解析を行った。未治療、メトホルミン単独、抗PD-1抗体単独、両者の併用の４群でそれぞれCD8TILsおよび腫瘍細胞をFACSソート回収しそれらの遺伝子発現を RNAseq 法を用いて解析した。その結果、メトホルミンと抗PD-1抗体の併用により生まれる相乗効果のメカニズムについて明らかにすることができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
現在までの進捗状況は概ね良好である。２系統のコンディショナルKOマウスを用いてCD8TILsの免疫学的解析を行うことができた。また、腫瘍組織のin situ代謝解析法を用いて、実際に腫瘍片等における代謝産物のイメージングを行うことができた。これは、慶応義塾大学との共同作業による。さらに、腫瘍に浸潤したCD8TILsおよび腫瘍細胞をFACSソート・回収し、その遺伝子発現が定量的解析することができた。これは、理化学研究所との共同作業による。２箇所の学外研究施設との共同研究が順調に遂行されたことが、何よりの大きな成果であった。免疫学的な解析は岡山大学で従来どおり行っており、特に問題は生じていない。以上のことから、進捗は概ね良好と判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
メトホルミン投与により、CD8TILsにおけるmTORC1/Nrf2/p62 axisが活性化されることが明らかになったが、オートファジー、グルタミノリシスとの関係をさらに詳細に詰めていく。mTORC1/Nrf2/p62 axisの活性化はCD8TILsの細胞増殖に必須であるが、IFNg産生には関係がない。また、解糖系とmTORC1/Nrf2/p62 axisの活性化の関係を明らかにする。
これまでのCD8TILsの解析は、フローサイトメトリーによる免疫学的解析が主であったが、今後は、免疫化学組織染色により、CD8TILsと腫瘍細胞の空間的関係を明らかにしていく。さらに、in situ 代謝解析法の結果と突き合わせて、より立体的に腫瘍微小環境における免疫細胞とがん細胞の攻防を可視化する。
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