2019 Fiscal Year Annual Research Report
非コードRNA遺伝子をゲノムワイドに発見する汎用システム
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18H04127
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
榊原 康文 慶應義塾大学, 理工学部(矢上), 教授 (10287427)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐々木 えりか 公益財団法人実験動物中央研究所, マーモセット医学生物学研究部, 部長 (70390739)
星野 敦 基礎生物学研究所, 多様性生物学研究室, 助教 (80312205)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 非コードRNA / 遺伝子発見 / バイオインフォマティクス / 深層学習 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
2019年度まで開発した非コードRNAクラスタリング手法CNNclustの改良版として，教師無し深層学習手法を適用した新たな非コードRNAクラスタリング用のアルゴリズムを設計して，その精度検証を行った．従来の手法と比べて，精度は劣ることなく，計算時間を大幅に高速化することができた．
分担者である佐々木より提供された健常マーモセットの解剖により採材した，左脳の島皮質，内側前頭皮質，海馬後部，前帯状皮質，尾状核と，右脳の視覚野の6部位に関して，Total RNA抽出後，次世代シークエンサーによってsmall RNA-Seqを行なった．得られたリードをドラフトゲノムにマッピングすることで，各部位における非コードRNA発現プロファイルを取得した．6部位における非コードRNA発現プロファイルを比較解析した結果，部位間で発現に違いがある非コードRNA遺伝子が存在することが判明した．
マーモセットにおいて非コードRNAの同定・アノテーションを進めるために，様々な小分子RNAが発現することが知られる生殖細胞を用いてsmall RNA-seqを行う．昨年度は，自己複製を行うことで持続的な精子産生を担う精子幹細胞においてsmall RNAの解析を開始した．精子幹細胞にはmiRNAだけでなくpiRNAも多く発現していそうなことが明らかになってきた．現在，それら小分子RNAの解析を行っている．
ゲノムを解読した標準系統のアサガオをクローンで育成して，根と花弁からtotal RNAを抽出した．花弁は発生段階を追ってサンプリングした．また、非コードRNA遺伝子の変異体を作成するための準備として，アサガオでのゲノム編集を進めた．また、非コードRNA遺伝子を発見するリファレンスとなるアサガオのゲノム配列の精度を向上するために、Saphyrシステムによる光学マッピングを試みた．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ゲノム配列から非コードRNA遺伝子を高精度に発見する汎用的な計算手法の開発は順調に進んでいる．教師無し深層学習手法を適用した新たな非コードRNAクラスタリング用のアルゴリズムの開発に目処が立った．さらに，次世代シークエンサーを用いたsmall RNA-Seqを試験的に行い，非コードRNA発現プロファイルを取得することに成功した．
マーモセット精子幹細胞のセルソーターによる単離，ライブラリー作製，シークエンシングと順調に進めることができた．詳細なインフォマティクス解析を行いたい．
当初は，発生が進んだ花弁からのtotal RNA抽出は極めて効率が悪く，得られたtotal RNAの純度も低かった．各種のプロトコールを試みて，最終的には凋れた花弁からも効率良く純度の高いtotal RNAが得られるようになった．ゲノム編集は機能欠損により花に可視的な表現型が現れることが期待される遺伝子への変異導入に成功した．光学マッピングは良好なデータが獲得できた．
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| Strategy for Future Research Activity |
2019年度まで開発した非コードRNAクラスタリング手法CNNclustの改良版として，教師無し深層学習手法を適用した新たな非コードRNAクラスタリング用のアルゴリズムの開発を加速化させ，既存他手法を精度で凌駕する．
同定したsmall RNAがどのようなRNAを標的として，自己複製，分化，ゲノムインテグリティーの維持といった精子幹細胞の働きにどのように関わっているのかを明らかにする．他のステージの生殖細胞のsmall RNA-seqも進める．
改良したプロトコールでアサガオの発生段階毎にtotal RNAを抽出して，RNA-seqにとりかかる．ゲノム編集により変異導入したアサガオを育成して花弁での表現型や変異の次世代への伝達を確認する．リファレンスゲノム配列の精度を向上するために，光学マッピングの結果の解析などを進める．
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