2021 Fiscal Year Annual Research Report
Designing the mammalian biological oscillators
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18H05270
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
上田 泰己 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 教授 (20373277)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大出 晃士 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 講師 (40612122)
清成 寛 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, チームリーダー (40721048)
史 蕭逸 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 助教 (40803656)
山田 陸裕 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, 上級研究員 (90469924)
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| Project Period (FY) |
2018-06-11 – 2023-03-31
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| Keywords | 可逆的リン酸化 / 振動子 / 概日時計 / CKI / 変異マウス作製 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、CKIδ/εを中心として、概日時計タンパク質が有する可逆的リン酸化制御機構の詳細な解析とマウス個体での表現型解析を用いてCKIファミリーを用いて可逆的リン酸化振動体を設計し、さらに生体リズム振動体一般の理解を目指すことを目指す。4年目は、これまでの解析で、CKIδ/εについては精製タンパク質を用いた生化学アッセイからの知見が蓄積していた一方で、基質についてはペプチドベースのアッセイを中心としていたことを鑑み、3年目から引き続き、基質タンパク質についても全長精製タンパク質の精製と性状解析を行うためのセットアップを行った。その結果、下記の成果を得た。
【1. CKIδ/ε脱リン酸化活性制御機構の解明 および 3. CKIファミリーを用いた可逆的リン酸化振動体の設計】CKIδ/ε脱リン酸化活性に影響を与えるリン酸化ペプチドの特性について、これまでに疑似リン酸化変異ではなくリン酸化ペプチドを用いる重要性を示してきたが、さらに疑似リン酸化修飾を化学的に導入したところやはり、リン酸化修飾が重要であることが裏付けれられた。さらに、これまでに脱リン酸化制御ペプチドに明確な配列保存性が見られないことと合わせて、CKIδ/ε脱リン酸化活性制御を調べるためには、全長の基質タンパク質の性状を調べる重要性を認識し、特に我々の研究チームで研究実績のあるCRYについて全長タンパク質の発現・精製を行う実験系を導入した。その結果、～90%以上の精製度で精製をCRYを得て、性状解析を行うことができた。
【2. CKIδ/ε脱リン酸化活性の個体レベルにおける意義の検証】
ウイルスベクターを用いたマウス個体行動への摂動系について、計画通りCKIを用いて摂動を与える系の構築に成功した。これまでに構築したCryを用いた摂動系と合わせて、脱リン酸化制御と個体行動リズムの関係を調べるために重要な実験系である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、概ね計画通りの研究が遂行できたが、特にCRYを中心とした全長基質タンパク質の精製系について、発現精製条件の様々な検討を経て、安定した精製系を得たことは、これまでのペプチド基質を中心とした解析から理解を進めるうえで重要であった。
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| Strategy for Future Research Activity |
計画最終年度である2022年度については、下記の２点にそれぞれ集中した研究開発を進める。
【1. CKIδ/ε脱リン酸化活性制御機構の解明 および 3. CKIファミリーを用いた可逆的リン酸化振動体の設計】これまでの研究で見出した、CKIδ/εおよびその基質タンパク質の有する脱リン酸化活性制御に関わる要素を総合し、CKI δ/εおよびその基質配列の組み合わせから、脱リン酸化活性制御が自律的に生じるための条件探索に注力する。
【2. CKIδ/ε脱リン酸化活性の個体レベルにおける意義の検証】これまでに構築したウイルスベクターを用いてマウス個体の概日リズムに摂動を与える系を用いて１.の活動で見出されてきた、CKIδ/εおよびその基質タンパク質の有する脱リン酸化活性制御に関わるアミノ酸残基の役割をマウスの個体行動レベルで検証する。
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Research Products
(22 results)
