2019 Fiscal Year Research-status Report

Molecular mechanisms underlying the selective membrane localization of bacterial lipoproteins

Research Project

Project/Area Number	18K05396
Research Institution	Morioka College
Principal Investigator	徳田元盛岡大学, その他部局等, 名誉教授 (40125943)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	垰和之東京大学, アイソトープ総合センター, 助教 (00211996) 村上聡東京工業大学, 生命理工学院, 教授 (30300966) 成田新一郎盛岡大学, 栄養学部, 教授 (30338751)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	リポ蛋白質 / ABCトランスポーター / 選別シグナル / 膜局在化 / 化学架橋
Outline of Annual Research Achievements	細菌に広く存在するリポ蛋白質の膜局在化機構を、大腸菌で解析することを目的にして本研究を展開している。昨年度は、リポ蛋白質を細胞質膜から遊離するABCトランスポーターであるLolCDE複合体の構造モデルを、薬剤排出に関わるABCトランスポーターMacBの結晶構造をもとに作製した。本年度は、この構造モデルにもとづき、膜サブユニットであるLolCとLolEのペリプラズム領域の機能に注目して解析した。この領域は、ペリプラズムシャペロンLolAにリポ蛋白質を受け渡す機能に重要である。これまでの解析からLolCはLolAと相互作用し、LolEはリポ蛋白質の結合部位であると考えられている。 LolCとLolEのペリプラズム領域、ならびに膜貫通領域にアンバー変異を導入し、アンバー変異特異的に光感受性のアミノ酸アナログpBPAが導入された変異体を多数構築した。これらの変異体をin vivoで光架橋し、LolAやリポ蛋白質との架橋形成を調べ、各サブユニットの機能分担と、ATPのエネルギーを利用したリポ蛋白質の遊離反応ならびにLolAへの受け渡し反応の詳細な分子機構を明らかにする。昨年度の研究で、LolEだけでなくLolCもリポ蛋白質と相互作用することが新たに見いだされた。以前の解析は、リポ蛋白質のペプチド部分にpBPAを導入して得られたものであるが、膜サブユニットにpBPAを導入したところ、LolCもリポ蛋白質と架橋することが明らかになった。この結合がリポ蛋白質の選別シグナルに依存しているかどうかを明らかにすることが本年度の課題である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 大腸菌におけるリポ蛋白質の選別は、アミノ末端から2番目のアミノ酸で決定され、アスパラギン酸の場合に細胞質膜残留型となり、それ以外のアミノ酸残基はすべて外膜移行型となることが確立している。外膜に移行する場合はLolCDE、LolA、外膜の受容体LolBにリポ蛋白質が順次受け渡され、LolBの働きで外膜に組み込まれる。昨年度の解析では、リポ蛋白質はLppのみを用いて解析したが、今年度はそれに加えてPalも用いた。これらのリポ蛋白質選別シグナルを細胞質膜残留型に変えた変異リポ蛋白質も作製し、LolC、LolEとの化学架橋を調べた。その結果、細胞質膜残留型のLpp、PalはどちらもLolCと架橋しないことが明らかになった。すなわち、この架橋は選別シグナルに依存したリポ蛋白質遊離反応の一部であると考えられる。今後の解析は、なぜアミノ末端2番目がアスパラギン酸の時にLolCDEとの相互作用ができないかを明らかにすることである。これまでの研究ではリン脂質がこの選別には重要であることが示唆されているので、今後はリン脂質と選別シグナル認識機構の関わりをin vitroで明らかにすることが課題である。
Strategy for Future Research Activity	リポ蛋白質の選別に対するリン脂質の影響を調べるため、化学架橋反応をin vitroで解析できる実験系を確立する。これまでの研究で、フォスファチジルエタノールアミン(PE)が選別に必須の役割をしていることが示唆されている。昨年度の実験は、in vivoで光架橋をしている。したがって、PEが選別に影響していると考えられる。細胞質膜を可溶化し、リン脂質の影響を無くした条件下で架橋できる実験系を構築する。この時外膜移行型リポ蛋白質がLolCDEと架橋するのかどうかが第一の興味である。架橋しなければリン脂質を加えて架橋するかどうかを調べる。すなわちin vitroでLolCDEにリポ蛋白質をチャージする条件を調べ、リン脂質の重要性を明らかに知る。次に、細胞質膜残留型リポ蛋白質についても同様のことを調べる。これらの実験により、LolCDEがリポ蛋白質と相互作用する時に必要な条件が明らかになると期待される。
Causes of Carryover	リポ蛋白質と相互作用する因子として新たにLolCが明らかになった。このため、研究の分担を少し変更することになった。この相談を年度末に予定していたが、新型コロナウイルス禍で相談を見合わせたため、実験の一部を来年度に凝り越した。また、同じ理由で福岡で開催予定であった農芸化学会が開催を見合わせたので出張旅費として予定した分が不要となった。