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2019 Fiscal Year Research-status Report

酵母染色体の部分異数体ライブラリー構築と育種への応用

Research Project

Project/Area Number 18K05402
Research InstitutionSojo University

Principal Investigator

笹野 佑  崇城大学, 生物生命学部, 准教授 (90640194)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 田口 久貴  崇城大学, 生物生命学部, 教授 (90212018)
原島 俊  崇城大学, 生物生命学部, 教授 (70116086)
Project Period (FY) 2018-04-01 – 2021-03-31
Keywordsゲノム工学 / CRISPR/Cas9 / 染色体工学 / 酵母
Outline of Annual Research Achievements

本研究では、出芽酵母を用いて、複数個所の遺伝子領域を重複ないし欠失させることで、染色体の異数性を大規模かつランダムに引き起こし、従来技術では得ら
れない多様なゲノム組成を持つ菌株集団を作製し、これを最終的に菌株育種へと応用することを目指すものである。
欠失による異数体作製については、昨年度、酵母染色体の末端領域計17領域をターゲットに、少なくとも2か所が欠失した菌株ライブラリーを作製した。これを用いて、発酵阻害物質であるフルフラールやHMFなどのフラン化合物含有培地での生育及び発酵生産性が向上した菌株を取得した。今年度は、より重要な遺伝子が多く含まれる内部領域26領域をターゲットに少なくとも2領域が同時に欠失したライブラリーの作製を行った。高温耐性等のストレス耐性株のスクリーニングまでには至らなかったが今後行っていく。また、昨年度までの結果を、実用バイオエタノール生産株に応用し、2つの染色体末端領域が欠失した菌株を作製した。それらの株は実験室酵母株と同様に、フラン化合物の分解速度が速くなり、結果的にこれら阻害物質存在下での発酵生産性が向上することを示した。
重複による異数体作製については、以前の申請者らの予備実験では少なくとも2か所の遺伝子領域の同時重複に成功していたが、今回、1か所の遺伝子領域の重複は成功するものの、2か所の遺伝子領域の同時重複を行うことが出来なかった。従って、複数領域が同時に重複した異数体ライブラリーは未だ作成できていない状況である。急遽、同時並行的に、二倍体酵母株を親株として、相同染色体の片方の遺伝子領域を欠失することで部分異数体を作製する試みも行っているが、まだ結果は得られていない

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

複数染色体領域の同時欠失については、当初の予定通り内部領域を対象とした菌株ライブラリーの作製に成功した。ストレス耐性株のスクリーニングまでは至らなかったものの、次年度に行う予定である。
複数染色体領域の同時重複については、技術的にも欠失よりも難しいこともあり、また担当学生の能力意欲不足等もありほとんど進展は見られなかった。

Strategy for Future Research Activity

複数染色体領域の同時欠失については、内部領域の欠失ライブラリーから高温耐性、フラン化合物耐性等の有用株をスクリーニングする。さらに、末端染色体領域においても行ったように、実用バイオエタノール生産株において内部染色体領域の欠失株を作製し、ストレス環境下での発酵生産性を評価する。
複数染色体領域の同時重複については、まずはライブラリーを作成したい。当初の予定ではCRISPR-PCDup法を用いた線状染色体として重複する方法を考えていたが、今までの試みではなかなか成功しないため、環状染色体として重複する、あるいは全く新しいアプローチとして染色体外環状染色体(EccDNA)として重複するということも考えている。予備的な実験ではポジティブな結果も得られている。

Causes of Carryover

本研究において、物品費の多くはPCR用のオリゴヌクレオチドプライマーが占める。欠失ライブラリーを作成するためにある程度購入したが、重複ライブラリーの作製にはまだ至っておらず、この分の物品費が今年度では使用できなかったため。

  • Research Products

    (6 results)

All 2020 2019

All Journal Article (3 results) (of which Peer Reviewed: 3 results) Presentation (3 results)

  • [Journal Article] CRISPR-PCD and CRISPR-PCRep: Two novel technologies for simultaneous multiple segmental chromosomal deletion/replacement in Saccharomyces cerevisiae2020

    • Author(s)
      Easmin Farhana、Sasano Yu、Kimura Shunta、Hassan Naim、Ekino Keisuke、Taguchi Hisataka、Harashima Satoshi
    • Journal Title

      Journal of Bioscience and Bioengineering

      Volume: 129 Pages: 129~139

    • DOI

      10.1016/j.jbiosc.2019.08.004

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] CRISPR-PCDup: a novel approach for simultaneous segmental chromosomal duplication in Saccharomyces cerevisiae2020

    • Author(s)
      Hassan Naim、Sasano Yu、Kimura Shunta、Easmin Farhana、Ekino Keisuke、Taguchi Hisataka、Harashima Satoshi
    • Journal Title

      AMB Express

      Volume: 10 Pages: -

    • DOI

      10.1186/s13568-020-0957-4

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] gRNA-transient expression system for simplified gRNA delivery in CRISPR/Cas9 genome editing2019

    • Author(s)
      Easmin Farhana、Hassan Naim、Sasano Yu、Ekino Keisuke、Taguchi Hisataka、Harashima Satoshi
    • Journal Title

      Journal of Bioscience and Bioengineering

      Volume: 128 Pages: 373~378

    • DOI

      10.1016/j.jbiosc.2019.02.009

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] 酵母の染色体異数性が清酒醸造に与える影響と酵母育種への応用2019

    • Author(s)
      堀田 夏紀、小高 敦史、松村 憲吾、杉山 峰崇、笹野 佑、原島 俊、秦 洋二、石田 博樹
    • Organizer
      第71回 日本生物工学会大会
  • [Presentation] 出芽酵母における任意領域の染色体外環状DNA化技術の開発2019

    • Author(s)
      生田 宗一郎, 久富 歩, 笹野 佑, 田口 久貴
    • Organizer
      第71回 日本生物工学会大会
  • [Presentation] 複数染色体領域の欠失による発酵阻害物質耐性出芽酵母菌株の育種2019

    • Author(s)
      豊留あいり、高田和真、高木佑希子、笹野 佑、田口久貴
    • Organizer
      第26回 日本生物工学会九州支部 長崎大会

URL: 

Published: 2021-01-27  

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