2019 Fiscal Year Research-status Report
哺乳類卵子・初期胚の常温長期保存に関する研究～遺伝資源保存への適用を目指して～
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18K05691
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| Research Institution | Juntendo University |
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Principal Investigator |
多田 昇弘 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 先任准教授 (50338315)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | マウス / 初期胚 / 真空乾燥 / 常温保存 / トレハロース / CRISPR/Cas9 / 電気穿孔法 / バイオリソース |
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| Outline of Annual Research Achievements |
遺伝子改変マウスのような貴重な遺伝資源を保存するための方法として凍結保存に代わり得るような真空乾燥・常温保存法をマウスの生殖機能細胞を用いて開発するために、本研究を実施した。
本研究では、乾燥保護物質としてトレハロースに着目し、トレハロースを含む保存液を用いて種々の条件下でマウス初期胚について真空乾燥処理を行い、室温保存後の生存性について確認した。まず、トレハロースが高分子であるため細胞内に取り込まれないので、取り込むことができるノックインマウスの作製を試みた。このマウスは、トレハロースのような糖が細胞膜を通過する際に関与している膜蛋白質トレハローストランスポーター1 (Tret1)を初期胚の細胞膜で発現することが期待される。ノックインマウスは、ゲノム編集(CRISPR/Cas9)により、ドナーベクター(CAG promoter-PvTret1-IRES2-AcGFP1; CTIG)をROSA26遺伝子座のセーフハーバー領域に対するsgRNA及びCas9蛋白質と共にマウス1-細胞期卵の細胞質内に顕微注入後、これらの1-細胞期卵をレシピエントマウスに移植することにより作製した。その後、PCRによる遺伝子解析を行ったところ5匹のマウスでCTIGがノックインされていることを認めたが、シークエンス解析を行ったところ、いずれのマウスも完全な形でCTIGがノックインされていないことがわかった。そこで、ROSA26遺伝子座のセーフハーバー領域の別のサイトにノックインできるようsgRNA及びCTIGを再構築した。
これらの再構築したsgRNA及びCTIGを用いてノックインマウス作製を試みたところ、4匹のマウスが得られた。現在、遺伝子解析を行っているところである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
トレハローストランスポーターを細胞膜で発現するノックアウトマウス作製において、マウス自体は作製できたが、ドナーベクターがインタクトな状態でノックインされていなかった。そこで、再度、sgRNA及びドナーベクターをデザインし、構築し直して、マウスを作製したため、予定より進捗が遅れてしまった。また、トレハロースを細胞内に取り込むための別の手段として電気的穿孔法（エレクトロポレーション: EP）によりマウス初期胚の細胞膜に小孔を開け、トレハロースを取り込むことを試みるための前段階として、ローダミンデキストラン(3kDa)を効率良くエレクトロポレーションで取り込める条件を決めることができた。通常、マウス初期胚にEPを実施する場合、Porting pulse及びTransfer pulseの2段階でパルスをかけることにより、初期胚の透明帯及び細胞膜に順次穿孔を開けて行くことが知られているが、本実験では、Transfer pulseのみで初期胚の細胞内にローダミンデキストランを取り込むことができた。この理由として、初期胚を得るために、体外受精を行ったが、その際に用いた体外受精用培養液中に含まれる還元型グルタチオンにより、透明帯の脆弱化が生じたたため、Porting pulseをかけることなく、Transfer pulseのみでローダミンデキストランを細胞質内に取り込むことができたものと推測された。しかし、マウス初期胚へのエレクトロポレーションでのトレハロースの取り込みを確認するまでには至らなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
ROSA26遺伝子座のセーフハーバー領域にトレハローストランスポーター遺伝子をノックインしたマウス(ROSA26-CTIG-KIマウス)の遺伝子解析を行う。即ち、ROSA26遺伝子座のセーフハーバー領域からCTIGをまたぐようなプライマーセット及びCTIG内での複数のプライマーセットを設定し、PCRにより増幅されたPCR productsを得る。これらのproductsについてシークエンス解析を行い、ROSA26遺伝子座セーフハーバー領域の目的のサイトにドナーベクターがインタクトな形で挿入されていることを確認する。CTIGの挿入が確認されたノックインマウスについて、繁殖を行い、子孫を得た後、得られた子孫のマウス由来初期胚（1-細胞期卵、2-細胞期胚、8-細胞期胚、桑実期胚、胚盤胞）について種々の保存液（トレハロース、エピカテキン、アスコルビン酸を種々の濃度で含むPB1, M2, Tris-EGTAあるいはｍCZB-hepes）を用いて真空乾燥・常温保存を試み、復水後の生存性をトリパンブルー染色により透明帯及び細胞膜の損傷を確認する。なお、保存胚の復水に蒸留水、PB1, M2, Tris-EGTA及びmCZB-hepesを用いることにより、その後の胚の生存性を確認する。また、生存が認められた初期胚について卵管移植あるいは子宮内移植を試み、正常な産仔への発生を確認する。
一方、各ステージのマウス初期胚（体外受精由来）について、前述した種々の保存液に初期胚を浸漬した後、エレクトロポレーションを行った後、真空乾燥・常温保存を行い、復水後の生存性及び移植後の正常産仔への発生を確認する。
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| Causes of Carryover |
（理由）
物品費として、マイクロチューブ、チップ、カルチャーディッシュ、インジェクションピペット、ホールディングピペット、胚操作用ピペット、試薬（トレハロース、エピカテキン、アスコルビン酸、Tris-EDTA、ローダミンデキストラン、Cas9蛋白質）、培養液・緩衝液（CARD medium, Fertiup, Modified Whittin's medium, PB1, M2, mCZB-hepes）、sgRNA・ドナーベクターの合成・構築及び動物代（マウス）に支出したが、ノックインマウス作製に長時間を要したため、実験が予定通り遂行できなかった。
（使用計画）
物品費は、マウス飼育料、マイクロチューブ、チップ、カルチャーディッシュ、試薬（トレハロース、エピカテキン、アスコルビン酸、Tris-EDTA、ローダミンデキストラン、流動パラフィン、性腺刺激ホルモン、PCRキット等）、培養液・緩衝液（CARD medium, Fertiup, Modified Whittin's medium, PB1, M2, mCZB-hepes、エレクトロポレーション用緩衝液）、動物代（マウス）などの購入に充てる。また、得られた研究成果は、日本実験動物学会等に発表する予定であるが、その旅費に充てる。
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[Journal Article] Periostin deletion suppresses late-phase response in mouse experimental allergic conjunctivitis.2019
Author(s)
Asada Y, Okano M, Ishida W, Iwamoto S, Fukuda K, Hirakata T, Tada N, Fukushima A, Ebihara N, Kudo A, Matsuda A.
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Journal Title
Allergology International
Volume: 68
Pages: 233-239
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Hlf marks the developmental pathway for hematopoietic stem cells but not for erythro-myeloid progenitors.,2019
Author(s)
Tomomasa Yokomizo, Naoki Watanabe, Terumasa Umemoto, Junichi Matsuo, Ryota Harai, Yoshihiko Kihara, Eri Nakamura, Norihiro Tada, Tomohiko Sato, Tomoiku Takaku, Akihiko Shimono, Hitoshi Takizawa, Naomi Nakagata, Seiichi Mori, Mineo Kurokawa, Daniel Tenen, Motomi Osato, Toshio Suda, and Norio Komatsu.
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Journal Title
J Exp Med
Volume: 216
Pages: 1599-1614
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] KIF11 as a potential marker of spermatogenesis within mouse seminiferous tubule cross-sections.2019
Author(s)
Miki Yokoyama H. Kurihara, Shizuko Ichinose, Shozo Ichinose, Masaru Kurosawa, Norihiro Tada, Chihiro Iwahara, Hironori Matsuda, Kazue Terasawa, Katarzyna Podyma-Inoue, Koichi Furukawa, and Kazuhisa Iwabuchi.
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Journal Title
J Histochem Cytochem
Volume: 67
Pages: 813-824
DOI
Peer Reviewed
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