2020 Fiscal Year Research-status Report
哺乳類卵子・初期胚の常温長期保存に関する研究～遺伝資源保存への適用を目指して～
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18K05691
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| Research Institution | Juntendo University |
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Principal Investigator |
多田 昇弘 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 先任准教授 (50338315)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | マウス / 初期胚 / 真空乾燥 / 常温保存 / トレハロース / CRISPR/Cas9 / エレクトロポレーション / バイオリソース |
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| Outline of Annual Research Achievements |
マウス初期胚の真空乾燥・常温保存法を開発するために、本研究を行った。
ネムリユスリカの幼虫の乾燥耐性能力は、乾燥時に大量のトレハロースを合成し、体内全体に均一に分布、蓄積することによりガラス化転移を生じ、成体成分の保護機能が獲得されることに起因していることが明らかにされている。そこで、本研究では、乾燥保護物質としてトレハロースに着目し、マウス受精卵の真空乾燥に有効であるかどうかを確認した。まず、トレハロースは、細胞膜を通さないので、細胞質へトレハロースを取り込ませるために、トレハロース特異的なトランスポーター(PvTRET1; Trehalose transporter of P.vanderplanki)を細胞膜で発現するノックインマウスの作製を試みた。ノックインマウスは、ゲノム編集(CRISPR/Cas9)により、ドナーベクター（CAG promoter-PvTRET1-IRES2-AcGFP1; CTIG）をマウスROSA26遺伝子座のセーフハーバー領域に対するsgRNA及びCas9エンドヌクレアーゼ蛋白質と共にマウス受精卵（1-細胞期卵）の細胞質内に顕微注入後、これらの1-細胞期卵を24時間程培養し、2-細胞期胚に発生したものをレシピエントマウス卵管に移植することにより作製した。得られた5匹のマウスについて、PCR解析を行ったところ、CTIGがノックインされていることが認められたが、ROSA26遺伝子座のセーフハーバー領域ではなく、ランダムに挿入されていることがわかった。そこで、ROSA26遺伝子座セーフハーバー領域の別のサイトにノックインできるようなsgRNA及びドナーベクターを再度構築し、ノックインマウスの作製を試みた。その結果、4匹のマウスが得られ、内2匹にROSA26遺伝子座のセーフハーバー領域にドナーベクターCTIGをノックインされていることが認められた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
再構築したsgRNA及びドナーベクターを用いて作製したノックインマウスの遺伝子解析（シークエンス解析）において、ノックインされたROSA26遺伝子座のセーフハーバー領域（left arm, right arm）とドナーベクターの両間を認識するプライマー及びドナーベクター内の複数のプライマーを用いてPCRを行い、ドナーベクターのノックインサイトの同定を試みたが、ドナーベクターの長さが約5kbと長いため、同定するためのプライマーの設定に時間がかかり、同定に手間取った。また、ドナーベクターのIRES2の下流にAcGFP遺伝子が存在しているので、PvTRET1が発現していればAcGFPも発現していることが期待されたため、ノックインマウス由来受精卵でAcGFPの発現を蛍光顕微鏡下で確認した。その結果、微弱ではあるが細胞膜にAcGFPの発現が認められた。また、エレクトロポレーションによるマウス受精卵へのトレハロースの取り込みについては、トレハロース/ローダミンデキストラン混合液をエレクトロポレーションでマウス受精卵（1-細胞期卵）へ導入したところ、細胞内への取り込みが確認できた。しかし、実際にトレハロースが取り込まれたかどうかを確認するために、顕微赤外吸収スペクトル等を測定する予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
ノックインマウス(ROSA26-CTIG-KIマウス)について繁殖を行い、F2世代でホモのKIマウスを得る。これらのKIマウス由来の各ステージの初期胚（1-細胞期胚、2-細胞期胚、8-細胞期胚、桑実期胚、胚盤胞）を種々の保存液（トレハロース、エピカテキン、アスコルビン酸を種々の濃度で含むPB1, M2, Tris-EGTA, mCZB-hepes）に浸漬し、真空乾燥及び常温保存（1～14日間）を試み、復水後に生存性を確認する。なお、常温保存胚の復水には、蒸留水、PB1, M2, Tris-EGTA及びmCZB-hepesを用い、これらの有効性を確認する。また、形態的に正常で、生存が認められた胚については、偽妊娠を誘起したレシピエントマウスの卵管あるいは子宮内に移植し、胎児への発生を確認する。
一方、各ステージの体外受精由来マウス初期胚（1-細胞期胚、2-細胞期胚、8-細胞期胚、桑実期胚、胚盤胞）を、前述した種々の保存液中に浸漬し、エレクトロポレーションを行った後、真空乾燥及び常温保存（1～14日間）を行う。保存後、保存胚を復水処理を施し、生存性を確認する。形態的に正常で、生存が確認された胚は、偽妊娠誘起したレシピエントマウス卵管あるいは子宮に移植し、胎児への発生及び正常性を確認する。更に、移植後、得られた常温保存胚由来産仔については、離乳後、繁殖を行い、妊孕性及び正常な子孫が得られることを確認する。
これらの真空乾燥・常温保存胚が、復水後に正常な形態を維持していない場合、胚の透明帯、細胞膜、オルガネラ（核、小胞体、ゴルジ体、エンドソーム、リソソーム、ミトコンドリア）及び細胞骨格の変性及び破壊が考えられる。そこで、まず、核の正常性を確認するために、予め、脱核した新鮮なマウス未受精卵へ真空乾燥・常温保存胚由来の核を移入し、核置換卵を作製し、移植することにより発生の正常性を確認する。
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| Causes of Carryover |
（理由）物品費として、マイクロチューブ、チップ、カルチャーディッシュ、インジェクション/ホールディングピペット用ガラス管、胚操作ピペット用ガラス管、試薬（トレハロース、エピカテキン、アスコルビン酸、Tris-EGTA、ローダミンデキストラン、Cas9蛋白質）、培養液・緩衝液(CARD medium, Fertiup, Modified Whittin’s medium, PB1, M2, mCZB-hepes)、sgRNA及びドナーベクターの設計・構築並びに動物代（マウス）に支出したが、sgRNA及びドナーベクターの再構築及びノックインマウスのシークエンス解析に長時間を要したため、実験が予定通り遂行できなかった。
（使用計画）物品費は、マウス飼育料、マイクロチューブ、チップ、カルチャーディッシュ、試薬（トレハロース、エピカテキン、アスコルビン酸、Tris-EGTA、性腺刺激ホルモン；PMSG, hCG、ローダミンデキストラン、流動パラフィン、性腺刺激ホルモン；PMSG, hCG、PCRキット等）、培養液・緩衝液(CARD medium, Fertiup, Modified Whittin’s medium, PB1, M2, mCZB-hepes、エレクトロポレーション用緩衝液)、動物代（マウス）などの購入に充てる。また、得られた研究成果は、日本実験動物学会等に発表する予定である。
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Research Products
(7 results)
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[Journal Article] Low bone mineral density due to secondary hyperparathyroidism in the GlatmTg(CAG-A4GALT) mouse model of Fabry disease.2020
Author(s)
H Maruyama, A Taguchi, M Mikane, H Lu, N Tada, M Ishijima, H Kaneko, M Kawai, S Goto, A Saito, R Ohashi, Y Nishikawa, S Ishii.
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Journal Title
FASEB BioAdv.
Volume: 2
Pages: 365-381
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Expression of leukotriene B4 receptor 1 defines functionally distinct DCs that control allergic skin inflammation.2020
Author(s)
Tomoaki Koga, Fumiyuki Sasaki, Kazuko Saeki, Soken Tsuchiya, Toshiaki Okuno, Mai Ohba, Takako Ichiki, Satoshi Iwamoto, Hirotsugu Uzawa, Keiko Kitajima, Chikara Meno, Eri Nakamura, Norihiro Tada, Yoshinori Fukui, Junichi Kikuta, Masaru Ishii, Yukihiko Sugimoto, and Mitsuyoshi Nakao, Takehiko Yokomizo.
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Journal Title
Cellular & Molecular Immunology
Volume: 8
Pages: 1-13
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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