2019 Fiscal Year Research-status Report

Elucidating role of GTP hydrolysis in GTPase-driven mitochondrial membrane fusion

Research Project

Project/Area Number	18K06096
Research Institution	Kurume University
Principal Investigator	伴匡人久留米大学, 分子生命科学研究所, 講師 (00579667)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	ミトコンドリア / 膜融合 / GTPase / 脂質膜
Outline of Annual Research Achievements	ミトコンドリアは外膜と内膜の二重膜構造を持つオルガネラであり、融合と分裂によりその形態を制御している。これまでに融合を制御する因子として、酵母から哺乳動物まで広く保存されているGTP加水分解蛋白質（GTPase）が同定されており、哺乳動物の場合、外膜融合はMitofusin (Mfn)、内膜融合はOPA1が機能する。これらのGTPaseは、膜の変形に関わるダイナミン様GTPaseであることから、GTP加水分解によるエネルギーやコンフォメーション変化により膜融合制御に関わると考えられている。一方、膜融合以外にも、ミトコンドリア内膜の特徴的なクリステ構造の維持、ミトコンドリア-小胞体間の膜コンタクトサイトの形成にも機能するが、脂質膜上での挙動については不明な点が数多く残されている。そのために、これまでに世界に先駆けて、カイコ・バキュロウイルス発現により、OPA1の発現・精製法及び、人工脂質二重膜小胞（リポソーム）を利用したin vitro膜融合・結合法を確立し、膜融合の分子機構理解を進めている。2019年度は、この知見・経験を使い、カイコ・バキュロウイルス発現により発現・精製したMfnを組み込んだリポソームを使い、外膜融合の詳細な解析を進めた。Mfnは可溶性や発現量の問題から、透析で除去できる界面活性剤の利用が難しく、安定したMfnが組み込まれたリポソームの調製が困難であった。界面活性剤の濃度や除去法を検討することで、ミトコンドリア外膜をモデルとしたリポソームへのMfnの組み込み法を確立したことで、in vitro膜融合解析を行うことができるようになった。さらに、2018年度から引き続き、X線結晶構造解析によりOPA1の構造解析を進めている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason X線結晶構造解析に適した高純度・高濃度のOPA1の発現・精製法を確立し、海外の共同研究機関に於いて結晶化条件のスクリーニング・結晶解析を行っているが、有意な回析結果を得られていない。さらにコロナウイルスの影響により、進展が遅れている。一方、外膜融合の分子機能の解明に適したMfnの発現・精製法、リポソームへの組み込み法を確立できたので、計画通りにin vitro膜融合・膜結合アッセイによる研究を遂行できるようになった。
Strategy for Future Research Activity	ミトコンドリア外膜融合及び、ミトコンドリア-小胞体間の膜係留の分子機構の理解のために、Mfnの解析を進めていく。ミトコンドリア外膜や小胞体膜をモデルとしたリポソームにMfnを組み込むことで、脂質膜組成の違いが、MfnのGTP加水分解活性・会合体形成に及ぼす影響を解析し、選択的な機能発現の分子機構の解明を進めていく。さらに2か所あるcoild-coilやGTPaseドメインの変異体を作成し、各ドメインの膜融合・膜係留への寄与を明らかにする。これと並行して、引き続き、X線結晶構造解析によるOPA1の構造解析を進める。海外での共同研究の再開に備え、また高純度・高濃度のOPA1の調製を進める。さらに脂質混合のみならず内水相混合を検出できるアッセイ法の確立を行い、膜貫通領域を持つOPA1と膜貫通領域が欠損したOPA1の融合への寄与を明らかにする。この解析からミトコンドリア内膜中で起こるOPA1の蛋白質分解の生理的な意義をより明確にする。
Causes of Carryover	多くの消耗品等の購入が予想されるので、繰越を行った。