2019 Fiscal Year Research-status Report
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18K06229
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| Research Institution | Tokyo University of Technology |
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Principal Investigator |
十島 純子 東京工科大学, 医療保健学部, 教授 (00431552)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
十島 二朗 東京理科大学, 基礎工学部生物工学科, 教授 (00333831)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | エンドサイトーシス / 細胞内輸送 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Gタンパク質共役型受容体（GPCR）は様々な生理活性物質をリガンドとする細胞膜上受容体であり、創薬の主要な標的として重要な分子である。GPCRは特異的なリガンド分子の結合より活性化されるが、その不活性化はエンドサイトーシスによる細胞膜からの排除により制御されている。これまでの研究で、研究代表者らは、活性化したGPCRを特異的に標識する新しい蛍光GPCRマーカーの開発に成功し、そのマーカーを用いたエンドサイトーシス関連遺伝子の網羅的なスクリーニングを行なった。その結果、エンドサイトーシスに異常のある多数の出芽酵母変異体の単離に成功した。本研究は、スクリーニングにより得られた変異体の詳細な解析を通して、GPCRのエンドサイトーシス機構の全容を明らかにすることを目的とする。現在までに開発された医薬品の約50%はGPCRに作用する薬剤であり、本研究はそれらの疾患の原因の解明や、治療法の開発のための基盤となることが期待される。
本研究では、（1） GPCRのクラスリン小胞への取り込みにおける細胞膜脂質成分の役割、（２）細胞内へと取込まれたGPCRの初期エンドソームへの輸送機構、(3)GPCR輸送におけるゴルジ体－エンドソーム－リソソーム間の輸送制御機構の解明、の3つのプロジェクトが進行中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度はそれぞれの研究課題について、ほぼ計画通りに研究が実施し一定の成果を得た。研究課題 （1） GPCRのクラスリン小胞への取り込みにおける細胞膜脂質成分の役割、については、アクチンに重合に関与するRho1の活性化におけるPtdIns(4)P の役割について解析した。具体的には、(PtdIns) 4キナーゼである Stt4の温度感受性変異株 (stt4-1) とアクチン重合調節因子であるRho1の温度感受性変異体（rho1-42、研究課題2の研究内で作製）の二重変異体を作成した。その結果、二重変異体では生育速度やアクチン形態に相加的な異常が見られることが分かった。研究課題 （2） 細胞内へと取り込まれたGPCRの初期エンドソームへの輸送機構、については、取り込み後の輸送に重要であるPan1p（哺乳類 Eps15ホモログ）をプローブとしたラパマイシン誘導性二量体化法を用いて、小胞とアクチン骨格の結合を仲介する因子を解析した。その結果、小胞とアクチン骨格の結合に関わる新たな因子を同定した。研究課題(3) GPCR輸送におけるゴルジ体-エンドソーム-リソソーム間の輸送経路の解明については、ゴルジ体からのV型H+ポンプの輸送異常によりオルガネラの酸性化異常を指標に、変異体のスクリーニングを行った。酸性化異常は、phRodo-α-factor またはSte2-pHluorinを用いた。また、ゴルジ体からリソソームへ向かうVPS経路とエンドサイトーシス経路との関連について、トランスゴルジ網 (Trans golgi-network, TGN) からの小胞形成に関わるアダプタータンパク質の変異体を用いて蛍光エンドサイトーシスマーカーの輸送を解析した。その結果、クラスリンアダプタータンパク質の中で、GGA1とGGA2がエンドサイト-シス輸送に関連していることが分かった。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究課題(1)についてはゴルジ体のPtdIns(4)Pの産生がエンドサイトーシスに及ぼす影響を、PtdIns(4)Pの脱リン酸化酵素であるSac1やInp51/52/53pの変異体を用いて解析する。また、PtdIns(4)Pがクラスリン小胞の取り込みにおいて、アクチン重合に及ぼす影響についても解析を進める（研究課題2と関連）。研究課題(2)についてはラパマイシン誘導性二量体化法を用いて同定したクラスリン小胞-アクチン骨格間の結合に関わる因子について、Pan1pを含む複合体の役割を明らかにする。研究課題 (3)については、クラスリン小胞がエンドサイトーシス経路を輸送される際、ゴルジ体がどのような役割を果たしているかを解析する。また、phRodo-α-factor またはSte2-pHluorin の輸送に異常が見られた変異体の解析を行う。
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