2020 Fiscal Year Research-status Report
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18K06229
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| Research Institution | Tokyo University of Technology |
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Principal Investigator |
十島 純子 東京工科大学, 医療保健学部, 教授 (00431552)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
十島 二朗 東京理科大学, 基礎工学部生物工学科, 教授 (00333831)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | エンドサイトーシス / GPCR / 細胞内輸送 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
研究課題 （1） GPCRのクラスリン小胞への取り込みにおける細胞膜脂質成分の役割、については、ゴルジ体のPtdIns(4)Pの産生がエンドサイトーシスに及ぼす影響や、アクチン重合に及ぼす影響について、PtdIns(4)Pの脱リン酸化酵素であるSac1やInp51/52/53pの変異体を用いて解析する予定であったが、現在まだ変異体株の作成中であり、解析は進んでいない。研究課題 （2） 細胞内へと取り込まれたGPCRの初期エンドソームへの輸送機構、については、前年度の研究に引き続き、Pan1p（哺乳類 Eps15ホモログ）をプローブとしたラパマイシン誘導性二量体化法によりクラスリン小胞-アクチン骨格間の結合に関わる因子の解析を進めた。本年度はPan1pを異所性に発現させた際のクラスリンコートタンパク質やアクチン制御因子の動態を解析するために、これらを発現する細胞株を作成した。今後これらの細胞株を用いて解析を行う。また、Pan1p やその結合タンパク質のアクチン結合ドメインの欠損体がアクチン重合やエンドサイトーシスに及ぼす影響については解析を行い、Pan1pに加えEnt1p, Ent2pがこれらの過程に必要であることを明らかにした。研究課題(3) GPCR輸送におけるゴルジ体―エンドソーム-リソソーム間の輸送経路の解明については、クラスリン小胞がエンドサイトーシス経路を輸送される際、ゴルジ体がどのような役割を果たしているか解析した。本年度の研究では、蛍光エンドサイトーシスマーカがトランスゴルジ網（TGN）に局在するt-SNARE画分に取り込まれ、その後Rab5の局在するエンドソームと融合することを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
Gタンパク質共役型受容体（GPCR）は様々な生理活性物質をリガンドとする細胞膜上受容体であり、創薬の主要な標的として重要な分子である。GPCRは特異的なリガンド分子の結合より活性化されるが、その不活性化はエンドサイトーシスによる細胞膜からの排除により制御されている。以前の研究で研究代表者らは、活性化したGPCRを特異的に標識する新しい蛍光GPCRマーカーの開発に成功し、そのマーカーを用いたエンドサイトーシス関連遺伝子の網羅的なスクリーニングを行なった。本研究は、スクリーニングにより得られた変異体の詳細な解析を通して、GPCRのエンドサイトーシス機構の全容を明らかにすることを目的とし、（1） GPCRのクラスリン小胞への取り込みにおける細胞膜脂質成分の役割、（２）細胞内へと取込まれたGPCRの初期エンドソームへの輸送機構、(3)GPCR輸送におけるゴルジ体－エンドソーム－リソソーム間の輸送制御機構の解明、の3つのプロジェクを実施している。
本年度はcovid-19の感染拡大に伴い、学内での研究が厳しく制限されたこため、この間に計画していた実験がすべて延期となってしまった。これにより、研究の進捗は当初の計画よりも遅れている。よって、研究期間を延長し引き続き研究を実施する。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究課題(1)についてはゴルジ体のPtdIns(4)Pの産生がエンドサイトーシスに及ぼす影響について、Sac1pやInp51/52/53pの変異体に加え、フリッパーゼ（P4-ATPase）の変異体を作成し、これらの影響を解析する。研究課題(2)については昨年度作成した細胞株を用いて、ラパマイシン誘導性二量体化法によりPan1pを異所性に発現した際のクラスリンコートタンパク質やアクチン制御因子の動態を解析する。研究課題 (3)については、クラスリン小胞がエンドサイトーシス経路を輸送される際にゴルジ体を経由する意義について、リサイクルに対する影響を調べる。具体的には、TGNから細胞膜へリサイクルされるSnc1p (v-SNAREタンパク質)やFM4-64(蛍光脂質膜マーカ-)の局在を野生型とGGAs（ゴルジ体局在のクラスリンアダプタータンパク質）欠損体で比較する。
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| Causes of Carryover |
本年度は、緊急事態制限発令のため研究が制限された影響で、この間に計画していた実験がすべて延期となってしまった。これに伴い、いくつかの試薬について購入し直す必要がある。次年度使用金（57,558円）はこれら試薬の購入に充てる予定である。
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