2019 Fiscal Year Research-status Report
基本転写因子によるRNAポリメラーゼIIの構造変換の分子機構の解析
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18K06654
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| Research Institution | University of Toyama |
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Principal Investigator |
田中 亜紀 富山大学, 学術研究部薬学・和漢系, 助教 (50432109)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 転写開始から伸長への移行 / 基本転写因子 / RNAポリメラーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究ではRNAポリメラーゼIIの構造変換を制御する因子が、開始から伸長への移行段階でどのように入れ替わり、転写活性を制御しているのか解明することを目指す。RNAポリメラーゼIIのclamp領域は転写過程で動きが大きい領域であり、転写開始段階では基本転写因子TFIIEが、転写伸長段階では伸長因DSIFが結合している。我々はヒト組換え体clamp(rClamp)を用いた結合実験を行い、rClampとTFIIEの結合はTFIIB存在下でより強く結合し、転写伸長因子Spt5の添加は、rClampとTFIIBの結合を阻害することで、TFIIEがrClampから解離しやすくなることが明らかとなった。またクライオ電子顕微鏡により転写初期段階のPol IIと基本転写因子からなる複合体の構造が報告されており、CC(closed complex), ITC(initiation transcription complex), を比較するとTFIIEとPol II clampの結合部位が異なっており、これらを参考に点変異体を作成している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
2019年度は、一つ目の項目として、rClampおよびclampを制御する因子の変異体を用いて結合に必要なアミノ酸の同定を行う予定であった。変異体タンパク質の発現と精製方法を検討しており、結合実験による結合に必要なアミノ酸の同定が完了していない。二つ目の項目であるTFIIHによるTFIIEのリン酸化部位の同定は、精製CAK(CDK7, CycH, MAT1)によるTFIIEの試験管内リン酸化アッセイの条件検討中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. rClampおよびclampを制御する因子の変異体を用いて結合に必要なアミノ酸の同定を行うために精製と結合実験を行う。
2. TFIIHによるTFIIEのリン酸化部位の同定
TFIIEがPol IIから解離する機構の一つとして、我々はTFIIHによるTFIIEのリン酸化が関わると考えている。我々がTFIIHによるTFIIEのリン酸化を調べた結果、いくつかの標的部位の候補が見つかった。そこでこれらのアミノ酸のリン酸化の機能を調べるため、変異体を作成して結合に与える影響および転写活性に与える影響を調べる。
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| Causes of Carryover |
翌年度で使用が可能であるため、研究費を完全に使い切る処理を行わなかったため。
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