2020 Fiscal Year Research-status Report
基本転写因子によるRNAポリメラーゼIIの構造変換の分子機構の解析
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18K06654
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| Research Institution | University of Toyama |
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Principal Investigator |
田中 亜紀 富山大学, 学術研究部薬学・和漢系, 助教 (50432109)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | RNAポリメラーゼ / クランプ領域 / 基本転写因子TFIIE / 基本転写因子TFIIB |
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| Outline of Annual Research Achievements |
RNAポリメラーゼの構造変換の制御は転写活性に重要である。特にRNAポリメラーゼのクランプ(clamp)領域は非常に可動性の高い領域であり、転写の開始、伸長段階などの転写のステージにより位置が異なる。転写開始段階ではTFIIEが結合しており、転写伸長段階ではSPT5が結合している。このようなclamp領域に結合する因子による制御機構を理解することは、RNAポリメラーゼの活性制御機構を理解する上で重要となる。
実施した一つ目の項目は、ヒトPol II clamp(rClamp)を用いたclampを制御する因子の結合様式の検討である。前年度までのヒトrClampを用いた解析により、rClampとTFIIEの結合はTFIIBの存在下で増強されており、転写伸長因子であるSPT5の添加により、rClampとTFIIBの結合が阻害されて、TFIIEがrClampから解離しやすくなることが明らかとなった。転写の初期段階では転写に関わるCDK(CDK7, CDK8, CDK9, CDK19)によるリン酸化制御の重要性が報告されている。この中でCDK7は、TFIIEがPol IIにリクルートするTFIIHのサブユニットの一つであり、Pol IIをリン酸化することで転写開始を誘導する。CDK7はPol II以外のリン酸化標的の存在が指摘されている。そこでTFIIEとTFIIBのCDK7によるリン酸化のrClamp結合への影響を検討した。その結果、CDK7のリン酸化処理によるTFIIEとrClampの結合への影響は見なられないが、TFIIBはCDK7のリン酸化処理によりrClampとの結合が低下する可能性が示された。このことは転写に関わるCDKのPol II活性の制御機構の一つである可能性がある。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
①TFIIHによるTFIIEのリン酸化およびin vitro転写アッセイにより転写活性を評価する。この項目では、転写に関わるCDKによるリン酸化がclampとそれに結合して制御する因子の結合様式に影響を及ぼす可能性は示されたが、転写活性への影響を評価するために、in vitro転写アッセイの準備を進めているところである。
②Immobilized template PIC captureアッセイにより因子の集積を評価する点においては、現在、アッセイ系の確立を進めているところである。鋳型DNAの有無による因子の集積に差が見られず、条件検討を進めているところである。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在の進捗状況の欄で報告したアッセイ系の確立を目指すとともに、rClampおよびclampを制御する因子の変異体を用いた解析を進める。rClamp変異体は組換えタンパク質を精製したところであり、これらを用いたアッセイを進める。TFIIBおよびTFIIE,SPT5の変異体は、これまでの解析で用いた組換えタンパク質、および現在、組換えタンパク質の発現と精製を進めており、これらの変異体を用いて解析を進める。それにより、Pol IIのクランプ領域の制御機構の解明を目指す。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額は試薬および備品を購入するためには不足するため、翌年度分として試薬購入する際に使用することとした。
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