Involvement of mitochondria dysfunction induced by AGE-aggregated albumin in development of diabetic nephropathy

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18K06801
• Research Institution: Meijo University
• Principal Investigator: 永松 正 名城大学, 薬学部, 教授 (70103265)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 早川 伸樹 名城大学, 薬学部, 教授 (40340252) ; 水野 智博 名城大学, 薬学部, 助教 (40711669) [Withdrawn]
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 糖尿病性腎症 / AGEｓ / 凝集アルブミン / ネフリン / ポドシン / ポドサイト / メサンギウム細胞

Outline of Annual Research Achievements

健常者2名、腎症を発症していない糖尿病者1名の血清をゲル濾過カラムを用いて解析した。いずれの血清も280nmの吸収パターンにおいてT70～90分でのピークは認められなかった。抗HSA抗体を用いたELISAでの検討でもACAA様凝集タンパクはバックグラウンド程度であった。メサンギウム細胞（MCs）にコレステロール存在下で調製したAGE化した凝集アルブミン(ACAA)を取り込ませ培養した培養液を回収し、スピンカラムを用いてACAAを除去したConditinal Mediumをポドサイト実験に用いた。ポドサイトでのネフリン、ポドシン、シナプトポジンの発現を免疫蛍光法、RT-PCR、western blotting (WT)で解析した。RT-PCRでいずれのmRNAの発現を確認した。しかし、免疫蛍光法やWTでは検出できなかった。培養液に800 unit/mLのヘパリンを添加するとネフリンmRNAの発現が3倍以上増加した。ヘパリン処置したポドサイトを抗ネフリン抗体、抗ポドシン抗体、Hoechst 33342で染色して蛍光顕微鏡で観察した。その結果、ネフリンの発現が増加した。しかし、ポドシンの発現は不変であった。さらに、Conditional Medium、ACAAと同じ濃度のヒト血清アルブミンをMCsに取り込ませて調製したControl Mediumでポドサイトを培養した。通常の培養液で培養したポドサイトが80％以上のコンフルエントになるのに対して、実験ポドサイトは20％以下のコンフルエントであった。Conditional Mediumの濃度を連続希釈し、培養細胞数を5000個/wellに増加してRT-PCRでGAPDH mRNAの相対発現率で検討した結果、4倍希釈Conditional Mediumが実験には適切であることを見出した。