2019 Fiscal Year Research-status Report
A new subpopulation of astrocytes that subserve GABAergic neural transmission in the brain.
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18K06836
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| Research Institution | Nara Medical University |
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Principal Investigator |
和中 明生 奈良県立医科大学, 医学部, 教授 (90210989)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
竹村 晶子 奈良県立医科大学, 医学部, 助教 (70647049)
田中 達英 奈良県立医科大学, 医学部, 講師 (80567032)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | レーザーマイクロダイセクション / シングル細胞遺伝子発現解析 / 淡蒼球 / GABA伝達 / アストロサイト |
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| Outline of Annual Research Achievements |
レーザーマイクロダイセクション（LMD)で淡蒼球から細胞を分取することがかなり習熟してできるようになったので、R1年度はまずLMDによって、マウス淡蒼球から細胞をできるだけ多く取得することを目標とした。マウスは我々が以前から用いているOlig2-CreER：CAG-Flex-ChR-EGFP ダブルトランスジェニックマウスでOlig2アストロサイトはEGFPでラベリングを行い、同じ切片で抗GFAP抗体を用いた免疫染色でGFAPアストロサイトも同時に可視化した。この2重染色された切片（淡蒼球）からLMDを用いて1切片からそれぞれの系譜の細胞を500個づつ分取し、10切片分を集積して、都合5000個の細胞からRNAを抽出した。このRNAからDNA逆転写を行い、さらにReal-time PCRでGABA伝達系の分子（GABA受容体、GABAトランスポータ－）グルタミン酸再吸収系の分子であるGluT、アストロサイト特異的なマーカーであるS100βやALDHL1分子などの定量を行った。またそれぞれの系譜のマーカーであるOlig2及びGFAPの遺伝子発現も検討した。組織学的な検討で前もって想像されたように、Olig2アストロサイトにおいてはGFAP遺伝子の発現は低く、グリア型GABAトランスポーターであるGAT-3の発現が、GFAPアストロサイトに比して高いことが確認出来た。これと併行して公的発現遺伝子のデータベースを用いて、アストロサイトのクラスターの中でOlig2遺伝子を発現するサブクラスターがあるかどうかをコンピューター上で解析することが可能なことが判明し、本学神経内科、未来基礎医学講座の協力を得て、解析を行ったところIn silico解析でもOlig2アストロサイトの亜集団が存在すること、及びそれらはGABAトランスポーターであるGAT-1を強く発現することが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
シングル細胞遺伝子発現データベースを駆使することで、我々が行ってきたWetの結果とIn silicoの結果を突き合わせることが出来、我々が提唱してきた「Olig2アストロサイト」の存在とそれらがGABA伝達に強く関わる可能性を示唆することが出来た（論文投稿中）。GABA伝達への関与についてはアデノ随伴ウイルスに組み込んだGAT-3のショートヘアピンRNAをマウス淡蒼球に打ち込む実験が初年度につづいて進捗が見られないので、方針を変更してOlig2アストロサイトに特異的に発現している遺伝子群をまず広くリストアップして、そこからこれらOlig2アストロサイトの機能（GABA伝達に関わる分子を中心に）をR2年度におこなう予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
R2年度も引き続きIn silico解析とLMDによるWet遺伝子解析の比較検討を行う予定である。これと併行して、アデノ随伴ウイルスベクターを用いた、Olig2アストロサイト特異的な遺伝子ノックダウン系の構築と解析も行う予定である。
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