2018 Fiscal Year Research-status Report
A project intended for new diagnostic marker and therapy for mesothelioma based on ubiquitin-proteasome system
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18K06980
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| Research Institution | Asahikawa Medical College |
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Principal Investigator |
谷野 美智枝 旭川医科大学, 医学部, 教授 (90360908)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
北村 秀光 北海道大学, 遺伝子病制御研究所, 准教授 (40360531)
榊原 純 (小西純) 北海道大学, 大学病院, 講師 (50374278)
畠山 鎮次 北海道大学, 医学研究院, 教授 (70294973)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 悪性胸膜中皮腫 / 脱ユビキチン化酵素 / OTUB1 / 上皮間葉移行 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
悪性胸膜中皮腫はアスベスト暴露後長い潜伏期間ののち発症する悪性度の高い腫瘍である。悪性中皮腫は、外科的切除に加え、化学療法、放射線照射を組み合わせた集学的治療が行われるが、治療抵抗性を示し予後不良の疾患である。そのため、分子病理学的メカニズムを探索し新規の治療法を開発することは急務である。中皮腫では様々な遺伝子異常が報告されている一方で、分子標的薬のターゲットとなる、活性化型変異がほとんどないため、本研究では広くさまざまなシグナル伝達を制御するユビキチンープロテアソーム係に関する脱ユビキチン化酵素であるOTUB1に着目した。悪性胸膜中皮腫におけるOTUB1の役割を調べることを目的とする。
まず、5つの中皮腫細胞株H28、H2052、H2452、Meso-4、211Hおよび中皮細胞株Met-5Aを用いてRT-PCR、ウェスタンブロッティングを施行し、OTUB1の発現量の検討を行った。211HにpCX4-puromycin-OTUB1をトランスフェクションし、OTUB1の安定過剰発現株を作製した。また、CRISPR/Cas9 systemを用い、OTUB1のノックダウン211H細胞株を樹立した。この細胞株を用い、ウェスタンブロッティング、RT-PCRでシグナル伝達分子の発現を確認した。5種類の中皮腫細胞株では、Met-5Aと比較してタンパク質レベルではいずれも高い発現を認めた。しかし、mRNAでは正常細胞株よりも中皮腫細胞株で発現が低いことが確認できた。これらは、遺伝子変異と相関はしなかった。また、OTUB1の過剰発現211H細胞株において、コントロール株よりもリン酸化SMAD2/3の発現が増加していることが確認された。また、一過性の過剰発現株ではEMT様のEカドヘリンの減少、Nカドヘリンの増加が見られたが、安定過剰発現株では見られなかった。しかし、Slug、Snailの発現上昇が確認できた。ノックダウン細胞株においても、MET様のシグナルは確認できなかったが、Slugの発現が低下していた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
悪性胸膜中皮腫細胞株では正常中皮細胞株と比較しOTUB1の発現上昇が確認され、それを過剰発現、ノックダウンした細胞株の樹立ができた。ウェスタンブロッティング、RT-PCR法などを用いて蛋白発現、遺伝子発現の解析が施行できており順調にシグナル解析を進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後はさらに、フェノタイプとして、トランスウェル、マトリゲルアッセイにおいて遊走能、浸潤能を、増殖曲線で増殖能の解析を行う。さらには患者検体を用いて、免疫組織化学染色を行い臨床的意義を確認する予定である。
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| Causes of Carryover |
研究室に解析に必要なツールがありそれを利用したため物品費が低額に抑えられた。次年度の解析では物品費の増加、旅費の増加が見込まれる。
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