2018 Fiscal Year Research-status Report
遺伝子改変オルガノイドを用いたドライバー変異による正常胃粘膜の初期変化の解析
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18K07016
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
大上 直秀 広島大学, 医歯薬保健学研究科(医), 准教授 (60346484)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 胃癌 / 癌幹細胞 / スフェロイド / QPRT |
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| Outline of Annual Research Achievements |
進行胃癌のうち低分化腺癌は未だ予後不良の疾患であり、新規診断マーカー・治療標的の同定が急務となっている。本研究の目的は、RHOA、CDH1の変異により特異的に発現が誘導される遺伝子を同定し、胃癌の病態解明を通して新規診断マーカー・治療開発に資することである。
本年度は胃癌細胞株を材料にスフェロイドを作成し、胃癌の癌幹細胞関連遺伝子の同定を行った。スフェロイドは幹細胞を含むことが知られており、幹細胞の研究にしばしば用いられる。細胞が接着した状態と比較し、スフェロイドを形成した状態では、QPRT、CST2、ANKRD45遺伝子が特に発現が上昇していた。胃癌組織を材料に定量的RT-PCRで遺伝子発現を測定した結果、QPRTは80%、CST2は40%、ANKRD45は20%の胃癌組織で高発現していた。
QPRT遺伝子は、quinolinate phosphoribosyltransferaseをコードする遺伝子であり、トリプトファンからのNADの合成に関わる分子である。癌における文献を検索すると、甲状腺濾胞腺腫と癌との鑑別に有効であったとの報告があるが、消化管癌を含むその他の悪性腫瘍における報告は認められない。そこで胃癌組織を材料にQPRTの発現を免疫染色で解析したところ、138例中47例（34%）の症例で陽性像を認めた。臨床病理学的遺伝子との関連を解析した結果、QPRT陽性例は有意に深達度が深く、遠隔転移例が多く、またステージも進行していた。予後との関連を解析したが予後との関連はなかった。
以上の結果から、QPRT遺伝子は胃癌の癌幹細胞に重要な役割を担っている可能性があり、今後は胃癌の癌幹細胞における機能解析を行う。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は胃癌細胞株を材料にスフェロイドを作成し、胃癌の癌幹細胞関連遺伝子の同定を行った。細胞が接着した状態と比較し、スフェロイドを形成した状態では、QPRT、CST2、ANKRD45遺伝子が特に発現が上昇していることを見出した。これらの3個の遺伝子以外にも多数の癌幹細胞に関連する遺伝子を同定している。本研究の目的は胃癌の病態解明を通して新規診断マーカー・治療開発に資することである。癌幹細胞は癌細胞のもととなる細胞と考えられており、これらの遺伝子は癌の新規治診断マーカーとして有用である。さらに機能解析の結果、癌幹細胞の維持に重要な役割を有している場合、治療標的となる可能性がある。QPRTの機能解析は現在進行中であるが、癌幹細胞に関連していれば治療標的となるものであり、現在までの進歩状況としては順調といえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後はQPRTの機能解析を進めていくとともに、CST2、ANKRD45遺伝子の発現解析を行う。発現が胃癌において上昇していた場合、さらに機能解析を行う。
機能解析の方法として、胃癌細胞株を材料にRNAiを用いてノックダウンし、細胞増殖能をMTTアッセイで、浸潤能をInvasionアッセイを用いて解析する。またスフェロイド形成能をスフェロイドフォーメーションアッセイで解析する。さらに外科的に切除された胃癌組織を材料に免疫染色で、発現・局在を解析する。発現と臨床病理学的因子、予後との関連を明らかにする。
これらに加え、外科的に切除された胃癌の非癌部胃粘膜を材料にオルガノイドを作成する。非癌部胃粘膜のオルガノイドを材料に、上記遺伝子の変異をCRISPER-Cas9システムを用いて導入し、GeneChipを用いて網羅的遺伝子発現解析を行う。胃癌細胞株のデータと合わせて変異株で発現が上昇している遺伝子のリストを作成し、文献検索を行い細胞表面に局在する蛋白質をコードする遺伝子を抽出する。さらに変異株において発現が上昇していた細胞表面蛋白質の免疫染色を行い、変異株のオルガノイドにおいてどのような細胞が染色されてくるのかを解析し、HE染色（ヘマトキシリン・エオジン染色）上で形態学的特徴を明らかにする。
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