2019 Fiscal Year Research-status Report
ミクログリアはニューロンに接触して何をしているのか？―疼痛モデルによる解析―
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18K07394
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| Research Institution | Kagoshima University |
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Principal Investigator |
八坂 敏一 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 准教授 (20568365)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
栗原 崇 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 准教授 (60282745)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 神経障害性疼痛 / 脊髄後角 / ミクログリ / 局所神経回路 / インターニューロン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
神経障害性疼痛は通常の鎮痛薬が奏効しないことが多く、原因解明と新規治療法の開発が急務である。この病態は末梢神経障害後に発症することが多く、動物の神経を損傷するモデルが確立しており、様々な研究が行われている。末梢神経損傷後、脊髄後角においてミクログリア（中枢神経系のマクロファージと呼ばれる）が増殖・活性化することがこの病態形成に深く関与していることが多く報告されている。これらの研究では、ミクログリアから放出される様々な分子が病態を引き起こすことに焦点が当てられているが、ニューロンとミクログリアの物理的な接触に関する報告はほとんど見られない。我々は、神経損傷後の脊髄後角において、増殖したミクログリアが約1割のニューロンに接触していることを観察した。この接触にどのような役割があるのかを調べるのが本研究課題の目的である。
脊髄後角には10種類以上の様々なインターニューロンが存在することから、ミクログリアが接触しているニューロンに選択性がある可能性が考えられた。これらのニューロンは興奮性と抑制性の2つに大別されるため、まず、抑制性ニューロンのマーカーであるPAX2の抗体を用いて免疫組織化学染色を行った結果、特に選択制はないと思われた。しかし実績のある抗体を用いたにも関わらず、染色結果に疑問が生じたため、抗体の再検討を異なる2種類の抗体について行い、信頼できる染色像が得られた。この免疫陽性細胞が本当に抑制性ニューロンであるかを確かめるため、抑制性ニューロンに蛍光蛋白質を発現している2種類の遺伝子改変マウスの組織を用いて3種類の抗体の確認を行った。その結果、新しく用意した抗体は確かに抑制性ニューロンを染めることが確認できた。今後、これらの抗体を用いてミクログリアと接触している細胞が抑制性かどうかを検討する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度はマウス神経障害性疼痛モデル動物の脊髄後角において、ミクログリアが接触しているニューロンが興奮性か抑制性かを同定することを目標としていた。しかし、当初論文に報告され実績のある抗体を用いて染色を行ったが、正しく評価されていないことが判明し、免疫組織化学染色のトラブルシューティング行うこととなった。新たな抗体を用いて綺麗な染色像を得られたが、その後の実験をより確実なものとするため、抑制性ニューロンに蛍光蛋白質を発現している2種類の遺伝子改変マウスの組織を用いて、これらの免疫染色の信頼性を評価した。その結果、新しい抗体による染色では、これらのマウス組織の蛍光蛋白質と非常によく共存し、抑制性ニューロンを標識できることが確認された。PAX2は抑制性ニューロンの分化に必要な転写因子であり、抑制性ニューロンのマーカーとして用いられているが、実際に成獣のマウスにおいてそれを検証した論文は未だにないようである。ラットについては一つ報告があるが、グリシン作動性とGABA作動性との区別がなされておらず、未だ結論には達していないと考えている。当初の予定ではなかったが、今回抗体の検討によって得られたデータを一つの論文としてまとめる予定にした。今後は当初予定していた、ミクログリアとニューロンの接触に関して、ニューロンの種類に選択制があるかどうかを調べることとする。また、シナプスの解析も行う予定で、プレシナプス及びポストシナプスのマーカーを用いて、興奮性及び抑制性シナプスの増減等を検討する。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、先ず現在行っているミクログリアが接触しているニューロンがPax2陽性かどうか、すなわち興奮性か抑制性かについて結論付ける。その結果、選択制が確認された場合、抑制性細胞ではニューロペプチドYやパルブアルブミン、ガラニン、カルレチニン、興奮性ではPKCγやカルレチニン、ニューロペプチドFF、ダイノルフィンといっサブグループのマーカーにより、それらに選択性があるのかどうかを更に調べる。また、興奮性か抑制性かについて特異性がなかった場合にも、興奮性にも抑制性にも一部の細胞で発現するような分子について検証する。今回研究対象としているニューロンとミクログリアの接触はニューロンの細胞体で観察されているものである。もし、細胞体へのシナプス入力がある場合には、この接触によってシナプスが除去されるような変化が予想される。一般的にニューロンの細胞体には抑制性シナプスが主に存在し、興奮性のシナプスは少ないとされる。予備実験においても細胞体には抑制性シナプスのマーカーが主に観察された。そのため、本研究では抑制性シナプスに焦点を当てて検討することとする。これらのシナプスが、ミクログリアの接触することによって除去されていれば、抑制性シナプスのマーカーが減少するはずである。予備実験を行ったが、現在のサンプリングではZ軸方向の厚みが10ミクロンで、細胞体を全て網羅することが困難であるため、厚みのあるデータのサンプリングを行い、ニューロンとミクログリアの接触とシナプス数に間に関連性があるかどうかを調べる。
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[Presentation] Parvalbumin-expressing cells gate a relay providing low-threshold mechanoreceptive input to lamina I projection neurons via vertical cells by the pre- and post-synaptic inhibition in the mouse spinal dorsal horn2019
Author(s)
Toshiharu Yasaka, Kieran A Boyle, Mark A Gradwell, Allen C Dickie, Erika Polgar, Robert P Ganley, Desmond P H Orr, Masahiko Watanabe, Victoria E Abraira, Emily D Kuehn, Amanda L Zimmerman, David D Ginty, Robert J Callister, Brett A Graham, David I Hughes
Organizer
Neuro2019（第42回日本神経科学大会、第62回日本神経化学会大会）
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