2018 Fiscal Year Research-status Report
Identification of causative bacteria for ulcerative colitis by using model mice and Maldi mass-spectrometer.
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18K08008
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
入江 厚 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 講師 (30250343)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
今村 隆寿 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 准教授 (20176499)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 潰瘍性大腸炎 / 質量分析 / HLA-DR / 小胞体ストレス / IgA / 疾患モデルマウス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
申請者らが樹立したHLA-DR4トランスジェニックマウス（HLA-DR4tgm）のホモ接合体は、何らかの腸内細菌の存在により誘導される大腸上皮細胞の小胞体ストレスが原因で大腸炎を自然発症する。大腸炎を発症したHLA-DR4tgmの糞便中には、IgAを結合した細菌が多数存在するが、未発症マウスではわずかである。また抗生剤４種混合物を飲水投与することにより、HLA-DR4tgmホモ接合体の大腸炎発症は有意に抑制される。そこで本研究では、大腸炎発症マウスの糞便中のIgA結合細菌中に起因菌が存在するのではないかと考え、当該起因菌を同定することを目的とする。
当初はIgA結合細菌を，抗マウスIgA抗体マイクロビーズを用いて分離し、これをプレートにまき、生じるコロニーをMaldi型質量分析計により網羅的に同定し、その中からHLA-DR4tgmに投与して大腸炎を発症させるものを特定するの研究計画であった。この計画とは別に、大腸炎発症を抑制する抗生剤のスペクトルから起因菌候補を絞り、大腸炎発症マウスの糞便中から得られた細菌の中からHLA-DR4tgmに投与して大腸炎を発症させるものを特定する実験も並行しておこなった。
以上の結果、後者の実験からある細菌Ｘを特定し、抗生剤の投与により同細菌を駆除することによりHLA-DR4tgmホモ接合体の大腸炎発症が抑制されること、同細菌を駆除したHLA-DR4tgmホモ接合体に、単離培養した同細菌を投与すると大腸炎を発症することを見出した。したがって、同細菌は本マウスが発症する大腸炎の起因菌の１つであると考えられる。培養した細菌Ｘは大腸炎発症マウスの血清を加えることにより、当該血清中のIgAが結合することがフローサイトメトリーにより確認され、IgA結合細菌の１つであることが確認できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初計画のMaldi型質量分析計による腸内細菌の同定方法では、細菌が十分量培養できるか、質量スペクトルから確実に細菌が同定できるのか、などの網羅的な解析を行う過程での問題点が予想された。しかし同方法を迂回することにより、結果的にはHLA-DR4tgmホモ接合体が発症する大腸炎の起因菌が、実験計画通り初年度に完遂できたのでおおむね順調に進展していると考える。特に細菌Ｘ投与後のマウスは、時間経過や発症する病態が自然発症のものと酷似しているため、本マウスは新規の潰瘍性大腸炎モデルマウスとして、その病態の解析に有用なツールとなる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は細菌Xがヒトの潰瘍性大腸炎患者に存在するのかどうか、同細菌の持つどのような分子がマウスの大腸炎を引き起こすのか、あるいは炎症を伴う免疫応答を惹起するのか、について解析を行う予定である。今年度以降の実験計画にしたがい、定量PCR法によりマウス糞便中の細菌Ｘ量を経時的に測定し、起因菌量と病態の関係をモニターし、大腸炎の諸症状の発症時期の予測できないか検討する。また、ヘリコバクター・ピロリが胃炎を起こす分子機構などを参考にして、細菌Ｘが持つ大腸炎を誘発する可能性がある分子の遺伝子をCRISPR/Cas9法により潰した細菌Ｘを作成し、これらがHLA-DR4tgmホモ接合体に大腸炎を発症させるのか否かを検討する。大腸炎発症マウスの血清中のIgAが培養した細菌Ｘに結合することがわかったので、その抗原を同定する目的で細菌Ｘのたんぱく質を二次元電気泳動で展開し、これに当該マウスの血清を添加して、抗体分子が結合するたんぱく質スポットを特定する。ついでこれらを常法にしたがいペプチドに分解して質量分析を行い、IgAの抗原分子を同定する。以上より得られる情報を統合して、細菌Ｘによる大腸炎発症の分子機構を検討する。
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| Causes of Carryover |
本年度３月分の共同実験施設使用料ならびに実験動物飼育施設使用料が翌年度の４月に請求されるため、その費用として留保した。翌年度に請求され次第使用する。
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Research Products
(3 results)
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[Journal Article] Bladder cancer-associated cancer-testis antigen-derived long peptides encompassing both CTL and promiscuous HLA class II-restricted Th cell epitopes induced CD4+ T cells expressing converged T-cell receptor genes in vitro.2019
Author(s)
Tsuruta M, Ueda S, Yew PY, Fukuda I, Yoshimura S, Kishi H, Hamana H, Hirayama M, Yatsuda J, Irie A, Senju S, Yuba E, Kamba T, Eto M, Nakayama H, Nishimura Y
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Journal Title
Oncoimmunology
Volume: 7
Pages: e1415687
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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