2020 Fiscal Year Research-status Report

エクソゾームを利用した膵癌幹細胞標的療法の開発

Research Project

Project/Area Number	18K08627
Research Institution	Kagoshima University
Principal Investigator	松原修一郎鹿児島大学, 医歯学総合研究科医学系, 客員研究員 (60199841)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	新地洋之鹿児島大学, 医歯学域医学系, 教授 (60284874) 高尾尊身鹿児島大学, 医歯学総合研究科, 客員研究員 (80171411) 下野隆一香川大学, 医学部, 准教授 (60404521)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2022-03-31
Keywords	癌幹細胞 / 膵臓癌 / CD133 / エクソゾーム / microRNA / mTOR / KRAS / Akt
Outline of Annual Research Achievements	昨年度、エクソゾームを用いた標的療法をめざして標的分子の検索に力点をおいて研究をすすめた結果、mTORC1(mTOR複合体1)とAktの同時阻害が膵癌細胞の幹細胞性抑制に有効であることが明らかになった。この結果を論文にまとめて投稿したところ、1種類の細胞株のみでの実験結果では、不十分であるとの指摘を受け、これまでCD133陽性細胞株Capan-1M9でおこなってきた実験の結果が、他の膵癌細胞株でもみられるかを確認するため、もう一つの膵癌細胞株PANC-1で実験をおこなった。セリン / スレオニン・キナーゼmTORは、細胞内で2種類の異なった複合体mTORC1およびmTORC2(mTOR複合体2)を形成して働いているが、mTORC1およびmTORC2の両方に作用する阻害剤KU-0063794の作用について調べ、これをラパマイシンと比較した結果、KU-0063794がより強力に幹細胞性を抑制すること、また、ラパマイシンに対する濃度依存性をみた時に観察されるplateauがKU-0063794ではみられないことがPANC-1細胞でも確認された。KU-0063794処理細胞では、(mTORC2によってリン酸化/活性化されると考えられている)Aktのリン酸化が抑制されているためと判断されるので、Aktの関与を確認するためmTORC1阻害剤ラパマイシンとAkt阻害剤を同時に投与したところ、Capan-1M9細胞と同様に強力な幹細胞性の抑制がみられ、PANC-1細胞でもAkt阻害が幹細胞性の抑制に有効であることがわかった。これらの結果をもとに、mTORおよびAktを標的とした短鎖抑制型RNAの配列を決定し、エクソゾームを用いて膵癌(幹)細胞に導入するべく実験をすすめている。また、膵癌細胞の放出するエクソゾームの解析をするため準備をすすめている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 昨年の報告書にも書いたように、米国のKalluri, R. らのグループよって、変異型KRASを標的としたsiRNAを発現するように遺伝子組み換えをした間葉系幹細胞を用いて治療用エクソゾームをつくらせ、これを膵癌患者に投与する研究がおこなわれており、すでに、バイオリアクターを用いてgood manufacturing practice (GMP)レベルのclinical-gradeエクソゾームの大量生産をする段階に達している。彼らの研究が非常にすすんでいることから、本課題の研究において独自性を維持するため全体の計画を再検討し、間葉系幹細胞を用いて短鎖抑制型RNAを産生するという実験は縮小し、当面はKRAS以外の新たな標的分子の検索に力を入れることとした。この結果、mTORC1の阻害とともにフィードバック機構によって起こるAktの活性化を抑えることが膵癌幹細胞の抑制に有効であることを明らかにすることができたが、この結果を論文にするのに予想以上の時間がかかってしまった。また、武漢肺炎ウイルス(SARS-CoV-2)騒動でいろいろな実験に遅れが生じ、当初予定していた免疫不全マウスへの移植腫瘍を用いたKU-0063794の投与実験も行えなかった。
Strategy for Future Research Activity	本年度の研究によって、KRAS以外の新たな標的遺伝子の検索とその作用機作の解明に一応の区切りがついたので、今後は短鎖抑制RNAの配列決定とともにエクソゾームを用いて細胞に作用させる実験に移る。同時に、癌幹細胞マーカーCD133陽性細胞とノックダウン細胞の産生するエクソゾームを解析し、両者の違いを手掛かりに癌幹細胞の抑制法を探る。具体的な実験のステップとしては、まず、膵癌細胞を用いてエクソゾームを分離精製し、CD133陽性細胞とノックダウン細胞の違いを検討する。次に、正常細胞(治療用エクソゾーム産生母細胞)、さらには遺伝子組み換え細胞(治療用エクソゾーム産生細胞)よりエクソゾームを分離精製して性質を調べるとともに、その作用を検討する。
Causes of Carryover	武漢肺炎ウイルス(SARS-CoV-2)騒動で、出席を予定していた学会がいずれもオンライン開催となったため、出張旅費を使う必要がなくなった。また、同じく武漢肺炎ウイルス(SARS-CoV-2)騒動でいろいろな実験に遅れが生じ、このため予定していた動物実験を断念してin vitroの結果のみで論文投稿することにしたので、動物実験用の費用を使わなかった。さらに、投稿雑誌の掲載料が本年より無料となったため掲載料として準備していた費用が不要となった。これらによって生じた助成金の次年度使用額は、延長期間中におこなうことを計画している癌細胞および正常細胞(治療用エクソゾーム産生細胞)からのエクソゾームの分離、解析実験に使用する。