膵癌幹細胞および腫瘍微小環境をターゲットとする個別化診療への展開

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K08646
• Research Institution: Yamaguchi University
• Principal Investigator: 永野 浩昭 山口大学, 大学院医学系研究科, 教授 (10294050)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 恒富 亮一 山口大学, 医学部附属病院, 講師 (10420514) ; 松隈 聰 山口大学, 医学部附属病院, 助教 (10634743) ; 徳光 幸生 山口大学, 医学部, 助教(寄附講座等) (40593299)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 癌幹細胞 / 膵癌 / 癌周辺微小環境

Outline of Annual Research Achievements

これまでに、膵癌細胞株から膵癌幹細胞様細胞（P-CSLC）を誘導する方法を開発しCalreticulin（CRT）が膵癌幹細胞の新規マーカーとなることを報告した。特に、誘導した膵癌CSLC (P-CSLC)より豊富な細胞集団と親細胞に発現している分子を、Proteomicsの手法で比較し、小胞体における分子シャペロンとして知られる
Calreticulin (CRT) は、P-CSLCの細胞膜上で高発現していることを見出した。本研究では、この結果を応用し、プロテオミクス、メタボロミクス、次世代シーケンサーを用いたmRNA解析という網羅的なアプローチを通して、膵癌幹細胞の新たな治療標的を同定する。つまり、我々の開発したP-CSLC誘導法とCRTを用いることで、効率的に膵癌幹細胞の病態解明と新たな治療ターゲットの同定が可能になり、癌幹細胞に対する有効な治療開発の端緒としたい。初年度は、網羅的なアプローチによるCRT陽性P-CSLCに高発現した数種類の分子と同細胞での活性化した代謝経路を同定する。さらに癌幹細胞性および癌悪性化、治療標的としての可能性という観点から、標的分子の絞り込みを行う。また、P-CSLCとcancer associated fibroblasts (CAFs）の相互に関連している表面抗原などについても解析する。これらの研究を通して、膵癌幹細胞をターゲットとした新規治療法開発の礎を築く。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

CRT陽性細胞を、フローサイトメーターを用いたソーティングにより分離する。親細胞およびCRT陽性CSLCから、代謝産物、RNA、タンパクを抽出してきた。さら
に、タンパクは2次元電気泳動によるスポット比較により、CRT陽性CSLCに高発現したスポットを抽出し、Mass Spectrometry（MS）により、分子同定を行った。
同様に、代謝産物はキャピラリー電気泳動およびMSによるスポット比較を行い、RNAは、教室で保有する次世代シーケンサー（NextSeq2000）を用いたRNAseqによ
りCRT陽性CSLCに高発現したmRNAの同定を試みた。これらの結果と体系的な解析 (GSE, Causal network、Pathway解析など) の中で、Cathepsin B、Annexin-Vな
どの分子がターゲット候補として同定され、現在膵癌臨床検体を用いてこれらの分子の発現の臨床的な意義について解析中である。

Strategy for Future Research Activity

膵癌CSLCに対する治療のターゲット選定
上記により絞り込んだ候補分子のsiRNA/shRNAによるノックダウンや低分子化合物による阻害がstemnessに及ぼす影響を解析する。具体的には、免疫不全マウスを用いた腫瘍原性、ABCトランスポーターの活性等に及ぼす影響を解析する。さらに候補分子の免疫細胞への影響については、免疫細胞との共培養試験で確認する。本解析には、翌年度も含め今後1年間を要すものと考えられる。
・CRT陽性P-CSLCとCAFsの関係
P-CSLCとCAFsの共培養システムにおいて、CAFsの存在下でCRT陽性P-CSLCの増殖能やStemness（主にABCトランスポーター活性とRT-PCRを用いたstemness, EMT
related geneの発現を用いて解析）に変化が生じるのか検討する。変化が確認できた場合は、P-CSLC、CAFsの培養液およびそれぞれの細胞をSecretome、RNAseqにより解析し、相互作用に関与している液性因子およびtranscriptional profileを解析する。なお、CRT以外の候補分子（CathepsinB,Annexin-V）についても同様の検討を行う。

Causes of Carryover

本年度の研究において、細胞培養の為の培地シャーレや培地の購入費を計上していたが、研究が順調に進んだことにより、予定より低額に抑えられたため、未使用額が生じた。
未使用額については、令和2年度の旅費、学会参加費、打ち合わせ等にかかわる旅費と併せて使用する。

Research Products

• [Journal Article] Preoperative chemoradiotherapy using gemcitabine for pancreatic ductal adenocarcinoma in patients with impaired renal function (2020)
  • Author(s): Tomimaru Yoshito、Eguchi Hidetoshi、Iwagami Yoshifumi、Akita Hirofumi、Noda Takehiro、Gotoh Kunihito、Kobayashi Shogo、Nagano Hiroaki、Mori Masaki、Doki Yuichiro
  • Journal Title: Cancer Chemotherapy and Pharmacology Volume: 85 Pages: 537～545
  • DOI: 10.1007/s00280-019-04005-y
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Efficacy of primary liver organoid culture from different stages of non-alcoholic steatohepatitis (NASH) mouse model (2020)
  • Author(s): 2.Elbadawy M, Yamanaka M, Goto Y, Hayashi K, Tsunedomi R, Hazama S, Nagano H, Omatsu T, Mizutani T, Katayama Y, Shinohara Y, Abugomaa A, Kaneda M, Yamawaki H, Usui T, Sasaki K
  • Journal Title: Biomaterials Volume: 237 Pages: 119823～119823
  • DOI: 10.1016/j.biomaterials.2020.119823
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A prospective, multi-center Phase I study of postoperative enoxaparin treatment in patients undergoing curative hepatobiliary-pancreatic surgery for malignancies (2020)
  • Author(s): Eguchi H, Kawamoto K, Tsujie M, Yukawa M, Kubota M, Asaoka T, Takeda Y, Noda T, Shimizu J, Nagano H, Doki Y, Mori M
  • Journal Title: Dig Surg Volume: 37(1) Pages: 81-86
  • DOI: 10.1159/000497451
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Novel Liquid Biopsy Test Based on a Sensitive Methylated SEPT9 Assay for Diagnosing Hepatocellular Carcinoma. Hepatol Commun (2020)
  • Author(s): Kotoh Y, Suehiro Y, Saeki I, Hoshida T, Maeda M, Iwamoto T, Matsumoto T, Hidaka I, Ishikawa T, Takami T, Higaki S, Fujii I, Suzuki C, Shindo Y, Tokumitsu Y, Nagano H, Sakaida I, Yamasaki T
  • Journal Title: Hepatol Commun Volume: 4(3) Pages: 461-470
  • DOI: 10.1002/hep4.1469
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] “Logic-based medicine” is more feasible than “evidence-based medicine” in the local treatment for hepatocellular carcinoma (2020)
  • Author(s): Sakon M, Kobayashi S, Wada H, Eguchi H, Marubashi S, Takahashi H, Akita H, Gotoh K, Yamada D, Asukai K, Hasegawa S, Ohue M, Yano M, Nagano H
  • Journal Title: Oncology Volume: 98(5) Pages: 259-266
  • DOI: 10.1159/000505554
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] TCR sequencing analysis of cancer tissues and tumor draining lymph nodes in colorectal cancer patients (2019)
  • Author(s): Matsuda T, Miyauchi E, Hsu YW, Nagayama S, Kiyotani K, Zewde M, Park JH, Kato T, Harada M, Matsui S, Ueno M, Fukuda K, Suzuki N, Hazama S, Nagano H, Takeuchi H, Vigneswaran WT, Kitagawa Y, Nakamura Y
  • Journal Title: Oncoimmunology Volume: 8(6) Pages: -
  • DOI: 10.1080/2162402X.2019.1588085
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A double-blind randomized comparative clinical trial to evaluate the safety and efficacy of dendritic cell vaccine loaded with WT1 peptides (TLP0-001) in combination with S-1 in patients with advanced pancreatic cancer refractory to standard chemotherapy (2019)
  • Author(s): Katsuda M, Miyazawa M, Ojima T, Katanuma A, Hakamada K, Sudo K, Asahara S, Endo I, Ueno M, Hara K, Yamada S, Fujii T, Satoi S, Ioka T, Ohira M, Akahori T, Kitano M, Nagano H, Furukawa M, Adachi T, Yamaue H
  • Journal Title: Trials Volume: 20(1) Pages: 242
  • DOI: 10.1186/s13063-019-3332-5
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A Prospective, Randomized Phase II Study of Adjuvant Gemcitabine Versus S-1 After Major Hepatectomy for Biliary Tract Cancer (KHBO 1208): Kansai Hepato-Biliary Oncology Group (2019)
  • Author(s): Kobayashi S, Nagano H, Tomokuni A, Gotoh K, Sakai D, Hatano E, Seo S, Terajima H, Uchida Y, Ajiki T, Satake H, Kamei K, Tohyama T, Hirose T, Ikai I, Morita S, Ioka T; Kansai Hepato-Biliary Oncology (KHBO) Group
  • Journal Title: Ann Surg Volume: 270(2) Pages: 230-237
  • DOI: 10.1097/SLA.0000000000002865
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Essential updates to the surgical treatment of biliary tract cancer (2019)
  • Author(s): Matsukuma S, Tokumitsu Y, Shindo Y, Matsui H, Nagano H
  • Journal Title: Ann Gastroenterol Surg Volume: 3(4) Pages: 378-389
  • DOI: 10.1002/ags3.12266
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Identification of a promiscuous epitope peptide derived from HSP70 (2019)
  • Author(s): Matsui H, Hazama S, Tamada K, Udaka K, Nishimura Y, Miyakawa T, Doi S, Nakajima M, Kanekiyo S, Tokumitsu Y, Shindo Y, Tomochika S, Yoshida S, Iida M, Suzuki N, Takeda S, Yamamoto S, Yoshino S, Ueno T, Nagano H
  • Journal Title: J Immunotherapy Volume: 42(7) Pages: 244-250
  • DOI: 10.1097/CJI.0000000000000274
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Biomarkers in immunotherapy for cancer (2019)
  • Author(s): Shindo Y, Hazama S, Tsunedomi R, Suzuki N, Nagano H
  • Journal Title: Cancers (Basel) Volume: 11(9) Pages: -
  • DOI: 10.3390/cancers11091223
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Utility of scoring systems combining the product of tumor number and size with liver function for predicting the prognosis of patients with hepatocellular carcinoma after hepatectomy (2019)
  • Author(s): Tokumitsu Y, Shindo Y, Matsui H, Matsukuma S, Nakajima M, Suzuki N, Takeda S, Wada H, Kobayashi S, Eguchi H, Ueno T, Nagano H
  • Journal Title: Oncol Lett Volume: 18(4) Pages: 3903-3913
  • DOI: 10.3892/ol.2019.10688
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Improved survival of CAR-T and tumor-specific T cells caused by anti-PD-1 scFv-producing CAR-T cells (2019)
  • Author(s): Nakajima M, Sakoda Y, Adachi K, Nagano H, Tamada K
  • Journal Title: Cancer Sci Volume: 110(10) Pages: 3079-3088
  • DOI: 10.1111/cas.14169
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Intratumoural-infiltrating CD4+ and FOXP3+ T Cells as strong positive predictive markers for the prognosis of resectable colorectal cancer (2019)
  • Author(s): Kuwahara T, Hazama S, Suzuki N, Yoshida S, Tomochika S, Nakagami Y, Matsui H, Shindo Y, Kanekiyo S, Tokumitsu Y, Iida M, Tsunedomi R, Takeda S, Yoshino S, Okayama N, Suehiro Y, Yamasaki T, Fijita T, Kawakami Y, Ueno T, Nagano H
  • Journal Title: Br J Cancer Volume: 121(11) Pages: 983-984
  • DOI: 10.1038/s41416-019-0559-6
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Genomic profiles of colorectal carcinoma with liver metastases and newly identified fusion genes (2019)
  • Author(s): Oga T, Yamashita Y, Soda M, Kojima S, Ueno T, Kawazu M, Suzuki N, Nagano H, Hazama S, Izumiya M, Koike K, Mano H
  • Journal Title: Cancer Sci Volume: 110(9) Pages: 2973-2981
  • DOI: 10.1111/cas.14127
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Multicenter phase II study of biweekly XELIRI plus bevacizumab as second-line therapy in patients with metastatic colorectal cancer (JSWOG-C3 study) (2019)
  • Author(s): Suzuki N, Hazama S, Nagasaka T, Tanioka H, Iwamoto Y, Negoro Y, Yamauchi M, Kobayashi M, Okuda H, Fujishima N, Nishimura T, Yamanaka N, Toyota K, Mori Y, Nakagami Y, Shimokawa M, Nagano H, Okajima M
  • Journal Title: Int J Clin Oncol Volume: 24(10) Pages: 1223-1230
  • DOI: 10.1007/s10147-019-01473-3
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A Prospective, Open-Label, Multicenter Phase 2 Trial of Neoadjuvant Therapy Using Full-Dose Gemcitabine and S-1 Concurrent with Radiation for Resectable Pancreatic Ductal Adenocarcinoma (2019)
  • Author(s): Eguchi H, Takeda Y, Takahashi H, Nakahira S, Kashiwazaki M, Shimizu J, Sakai D, Isohashi F, Nagano H, Mori M, Doki Y
  • Journal Title: Ann Surg Oncol Volume: 26(13) Pages: 4498-4505
  • DOI: 10.1245/s10434-019-07735-8
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Clinical Practice Guidelines for Hepatocellular Carcinoma: The Japan Society of Hepatology 2017 (4th JSH-HCC Guidelines) a 2019 update (2019)
  • Author(s): Kokudo N, Takemura N, Hasegawa K, Takayama T, Kubo S, Shimada M, Nagano H, Hatano E, Izumi N, Kaneko S, Kudo M, Iijima H, Genda T, Tateishi R, Torimura T, Igaki H, Kobayashi S, Sakurai H, Murakami T, Watadani T, Matsuyama Y
  • Journal Title: Hepatol Res Volume: 49(10) Pages: 1109-1113
  • DOI: 10.1111/hepr.13411
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Objective Response by mRECIST Is an Independent Prognostic Factor for Overall Survival in Hepatocellular Carcinoma Treated with Sorafenib in the SILIUS Trial (2019)
  • Author(s): Kudo M, Ueshima K, Chiba Y, Ogasawara S, Obi S, Izumi N, Aikata H, Nagano H, Hatano E, Sasaki Y, Hino K, Kumada T, Yamamoto K, Imai Y, Iwadou S, Ogawa C, Okusaka T, Kanai F, Arai Y
  • Journal Title: Liver Cancer Volume: 8(6) Pages: 505-519
  • DOI: 10.1159/000503032
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Establishment of a Screening Method for Epstein-Barr Virus-Associated Gastric Carcinoma by Droplet Digital PCR (2019)
  • Author(s): Shuto T, Nishikawa J, Shimokuri K, Yanagi A, Takagi T, Takagi F, Miura O, Iida M, Nagano H, Takemoto Y, Harada E, Suehiro Y, Yamasaki T, Okamoto T, Sakaida I
  • Journal Title: Microorganisms Volume: 7(12) Pages: -
  • DOI: 10.3390/microorganisms7120628
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Association between polymorphisms in EGFR and tumor response during cetuximab and oxaliplatin-based combination therapy in metastatic colorectal cancer: Analysis of data from two clinical trials (2019)
  • Author(s): Maeda H, Hazama S, Iwamoto S, Oba K, Tsunedomi R, Okayama N, Suehiro Y, Yamasaki T, Nakagami Y, Suzuki N, Nagano H, Sakamoto J, Mishima H, Nagata N
  • Journal Title: Oncol Lett Volume: 18(5) Pages: 4555-4562
  • DOI: 10.3892/ol.2019.10787
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Induction of antigen specific CD8+T cell infiltration by a novel neoadjuvant vaccine containing HSP70 and GPC3 peptides plus soluble LAG-3 and Poly-IC: LC : Interim results of a Phase I study (2019)
  • Author(s): Tokumitsu Y, Hazama S, Doi S, Tamada K, Udaka K,Akinaga S, Koki Y, Uematsu T, Nakagami Y, Matsui H,Shindo Y, Kanekiyo S, Tomochika S, Iida M, Yoshida S,Suzuki N, Takeda S, Yoshino S, Ueno T, Nagano H
  • Organizer: 2019 ASCO Annual Meeting
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Cancer stem-like phenotypes including immune surveillance and its responsible genes in induced liver cancer stem-like cells. Poster (2019)
  • Author(s): Tsunedomi R, Yoshimura K, Kimura Y, Nishiyama M,Matsukuma S, Tokumitsu Y, Tomochika S, Iida M, Suzuki N, Takeda S, Yoshino S, Hazama S, Nagano H
  • Organizer: ESMO Asia Congress
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Analysis of T cells of HCC patients: From a phase I study of novel neoadjuvant vaccine PBMCs and TILs (2019)
  • Author(s): Nakagami Y, Hazama S, Doi S, Tamada K, Udaka K,Akinaga S, Adachi K, Ming Xu, Tokumitsu Y, Matsui H,Shindo Y, Tsunedomi R, Kanekiyo S, Tomochika S, Iida M,Yoshida S, Suzuki N, Takeda S, Yoshino S, Nagano H
  • Organizer: 7th International Conference of Federation of Asian Clinical Oncology(FACO)
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 肝転移能亢進を示す肝癌幹細胞におけるRAB3Bの特性 Characteristics of RAB3B in hepatoma stem-like sphere cells (2019)
  • Author(s): 恒富亮一、吉村 清、木村祐太、西山光郎、松隈 聰、新藤芳太郎、徳光幸生、友近 忍、吉田 晋、飯田通久、鈴木伸明、 武田 茂、山本 滋、吉野茂文、硲 彰一、上野富雄、永野浩昭
  • Organizer: 第28回日本がん転移学会学術集会・総会
• [Presentation] HCCに対する新規ネオアジュバントワクチン療法の第I相・試験－TILとPBMC解析－A phase I study of novel neoadjuvant vaccine for HCC: Interim analysis of TILs and PBMCs (2019)
  • Author(s): 中上裕有樹、硲 彰一、土肥 俊、玉田耕治、宇高恵子、徳光幸生、松井洋人、松隈 聰、新藤芳太郎、鈴木伸明、武田 茂、 永野浩昭
  • Organizer: 第78回日本癌学会学術総会
• [Presentation] 肝癌幹細胞様 Sphere 細胞において同定された RAB3B 遺伝子の役割 (2019)
  • Author(s): 恒富亮一、吉村清、松隈聰、飯田通久、鈴木伸明、武田茂、吉野茂文、硲彰一、上野富雄、永野浩昭
  • Organizer: 第78回日本癌学会学術総会
• [Presentation] First in human Phase I study of AI designed novel vaccination therapy for the patients with advanced solid tumors (2019)
  • Author(s): 中島正夫、硲 彰一、玉田耕治、宇高恵子、土肥 俊、松井洋人、松隈 聰、新藤芳太郎、徳光幸生、兼清信介、友近 忍、 吉田 晋、飯田通久、鈴木伸明、武田 茂、吉野茂文、上野富雄、永野浩昭
  • Organizer: 第23回日本がん免疫学会総会
• [Presentation] Induction of antigen specific CD8 T cell infiltration by a novel neoadjuvant vaccine： Interim results of a Phase I study (2019)
  • Author(s): 中上裕有樹、硲 彰一、土肥 俊、玉田耕治、宇高恵子、秋永士朗、構木泰信、植松俊成、徳光幸生、松井洋人、新藤芳太郎、 兼清信介、友近 忍、飯田通久、吉田 晋、鈴木伸明、武田 茂、吉野茂文、上野富雄、永野浩昭
  • Organizer: 第23回日本がん免疫学会総会
• [Presentation] ネオアンチゲンを標的としたがんワクチン療法の開発 (2019)
  • Author(s): 新藤芳太郎、硲 彰一、恒富亮一、徳光幸生、松井洋人、松隈 聰、兼清信介、友近 忍、吉田 晋、飯田通久、鈴木伸明、 武田 茂、吉野茂文、玉田耕治、永野浩昭
  • Organizer: 第57回日本癌治療学会学術集会
• [Presentation] 膵癌に対する術前化学療法の経験 (2019)
  • Author(s): 藤原康弘、新藤芳太郎、徳光幸生、松井洋人、松隈 聰、中島正夫、兼清信介、友近 忍、吉田 晋、飯田通久、鈴木伸明、 武田 茂、硲 彰一、上野富雄、永野浩昭
  • Organizer: 第57回日本癌治療学会学術集会
• [Presentation] 消化器癌に対する新規ペプチドワクチン療法第1相試験 (2019)
  • Author(s): 中島正夫、硲 彰一、玉田耕治、宇高恵子、土肥 俊、松井洋人、新藤芳太郎、徳光幸生、松隈 聰、友近 忍、飯田通久、 吉田 晋、鈴木伸明、武田 茂、永野浩昭
  • Organizer: 第57回日本癌治療学会学術集会
• [Presentation] 当科における切除不能膵癌に対する conversion surgery の治療成績 (2019)
  • Author(s): 新藤芳太郎、徳光幸生、松井洋人、中島正夫、松隈 聰、兼清信介、友近 忍、吉田 晋、飯田通久、鈴木伸明、武田 茂、 吉野茂文、硲 彰一、上野富雄、永野浩昭
  • Organizer: JDDW 2019 第27回日本消化器関連学会週間
• [Presentation] 膵癌術前化学療法が患者免疫学的プロファイルに与える影 響の検討 (2019)
  • Author(s): 中島正夫、硲 彰一、山本常則、山田健介、中上裕有樹、徳光幸生、松井洋人、新藤芳太郎、松隈 聰、兼清信介、友近 忍、 吉田 晋、飯田通久、鈴木伸明、武田 茂、吉野茂文、永野浩昭
  • Organizer: 第32回日本バイオセラピィ学会学術集会総会
• [Presentation] 新規がんペプチド 複合免疫療法の開発 (2019)
  • Author(s): 硲 彰一、鈴木伸明、吉田 晋、友近 忍、徳光幸生、新藤芳太郎、松井洋人、松隈 聰、中島正夫、中島千代、山本常則、 千々松日香里、中上裕有樹、武田 茂、飯田通久、兼清信介、玉田耕治、宇高恵子、吉野茂文、永野浩昭
  • Organizer: 第32回日本バイオセラピィ学会学術集会総会