2018 Fiscal Year Research-status Report
新規難聴遺伝子候補SLC12A2の細胞・動物モデルを用いた分子病態解析
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18K09336
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| Research Institution | 独立行政法人国立病院機構(東京医療センター臨床研究センター) |
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Principal Investigator |
務台 英樹 独立行政法人国立病院機構(東京医療センター臨床研究センター), その他部局等, 研究員 (60415891)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 遺伝性難聴 / 原因遺伝子 / ゲノム編集 / モデルマウス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
先天性難聴は新生児1,000人に1人の割合で発症する。本邦では現在19遺伝子154変異に対する保険検査が実施され、また代表者の所属する研究室でも既知難聴遺伝子を対象とした遺伝子解析を実施し、診断・治療方針の決定に役立てている。一方、原因が同定できない場合も多く、これには未同定の難聴遺伝子を原因とする場合が含まれる。代表者らは保険検査などで原因が同定できなかった難聴家系200家系以上に対し、新規難聴遺伝子の同定を目的として次世代シーケンサーを用いたエクソーム解析を実施し、その過程で新規の難聴原因遺伝子候補SLC12A2を3家系で同定してきた。
本研究では１）SLC12A2変異体のin vitro分子機能解析ならびに細胞内局在の検討、２）SLC12A2 exon21変異体のスプライシング活性評価、３）Slc12a2変異をもつ遺伝子改変動物モデルの作成と表現型解析の各実験を計画している。初年度（2018年度）はそのうち１）と３）について実験を開始した。１）については、3種類の各変異でCl-イオンの細胞内流入活性が有意に減少していることを明らかにした。また、３）についてはCRISPR/Cas9ゲノム編集法により330個のマウス受精卵に対し患者と等価の変異を導入した。17頭産仔中、9頭を遺伝子変異導入陽性疑いとして選択した。大部分の個体で遺伝子型が決定できなかった事実は、変異モザイクであることを反映していると考えられた。founder個体の聴力・行動評価を実施した。本マウス系統のオスはBackgroundの系統であるFVB/NJへの戻し交配が成功せず、本遺伝子koマウスのオスが精子無形成の表現型をとることと関連していると考えられた。現在、本マウス系統メスを用いて体外受精を実施し、マウス系統の樹立を目指している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
SLC12A2変異体のin vitro分子機能解析ならびに細胞内局在の検討を実施し、結果をまとめて現在国際誌に投稿中である。
また、次年度予算の前倒し支払申請を実施し、ゲノム編集法により、患者で同定されたものと等価の変異を導入したモデルマウスを作成した。founderマウスは繁殖能が著しく低く、統計的解析に十分なマウス個体数を得て各種測定を開始するために最低6か月はかかると想定されるため、本実験を前倒して開始したことは正しい判断であったと考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、まず１）SLC12A2変異体のin vitro分子機能解析ならびに細胞内局在の検討について、雑誌reviewerからの返信を待ち、必要項目の追加実験を行う予定である。
２）SLC12A2 exon21変異体のスプライシング活性評価について、2019年度より開始する。
３）Slc12a2変異をもつ遺伝子改変動物モデルの作成と表現型解析については、引き続きマウス系統の樹立と十分な変異ヘテロ個体数を得ることを目標とする。変異ホモ個体を得た後に、聴力測定、行動等の表現型評価、分子生物学、組織学的解析を実施する。
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| Causes of Carryover |
国際学術誌への発表にかかる英文校正費、印刷費用が、今後支払われる予定である。
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[Journal Article] Deterioration in Distortion Product Otoacoustic Emissions in Auditory Neuropathy Patients with Distinct Clinical and Genetic Backgrounds2018
Author(s)
Kyoko Kitao, Hideki Mutai, Kazunori Namba, Noriko Morimoto, Astuko Nakano, Yukiko Arimoto, Tomoko Sugiuchi, Sawako Masuda, Yasuhide Okamoto, Noriko Morita, Hirokazu Sakamoto, Tomoko Shintani, Satoshi Fukuda, Kimitaka Kaga, Tatsuo Mastunaga
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Journal Title
Ear and Hearing
Volume: Epub
Pages: Epub
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] IMSindel: An accurate intermediate-size indel detection tool incorporating de novo assembly and gapped global-local alignment with split read analysis2018
Author(s)
Daichi Shigemizu, Fuyuki Miya, Shintaro Akiyama, Shujiro Okuda, Keith Boroevich, Akihiro Fujimoto, Hidewaki Nakagawa, Kouichi Ozaki, Shumpei Niida, Yonehiro Kanemura, Nobuhiko Okamoto, Shinji Saitoh, Mitsuhiro Kato, Mami Yamasaki, Tatsuo Matsunaga, Hideki Mutai, Kenjiro Kosaki, and Tatsuhiko Tsunoda
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Journal Title
Scientific Reports
Volume: 8
Pages: 5608
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Presentation] Identification of SLC12A2 as a candidate of deafness gene in human2019
Author(s)
Hideki Mutai, Koichiro Wasano, Yukihide Momozawa, Yoichiro Kamatani, Fuyuki Miya, Sawako Masuda, Noriko Morimoto, Kiyomitsu Nara, Satoe Takahashi, Tatsuhiko Tsunoda, Kazuaki Homma, Mitsuaki Kubo, Tatsuo Matsunaga
Organizer
42nd Annual Midwinter Meeting, Association for Research in Otolaryngology
Int'l Joint Research
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