歯周病発症におけるTRPチャネルを介した口腔上皮バリア機能破綻の関与

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K09566
• Research Institution: Fukuoka Dental College
• Principal Investigator: 内田 邦敏 福岡歯科大学, 口腔歯学部, 講師 (20581135)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 八田 光世 福岡歯科大学, 口腔歯学部, 教授 (30344518) ; 吉住 潤子 福岡歯科大学, 口腔歯学部, 助教 (40596376) ; 山崎 純 日本大学, 生物資源科学部, 教授 (50230397)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 歯周病 / 口腔上皮 / TRPチャネル

Outline of Annual Research Achievements

ヒト口腔上皮細胞株にRT-PCR法並びにカルシウムイメージング法を用いてTRPチャネルの発現を解析した結果、TRPV3並びにTRPV4の発現を認めた。
ヒト口腔上皮細胞株を用いた３次元培養モデルを構築した。分化誘導後に雪片を作製し、ヘマトキシリン・エオシン染色を行い形態を観察した結果、顆粒層と角化層が観察されたが、角化層の厚さは薄く、角化の程度は弱いと考えられた。また、基底細胞層を除く正常扁平上皮細胞に発現するCK13で染色されることを確認した。
この3次元モデルを歯周病原菌の１つであるPorphyromonas gingivalis（Pg菌）の死菌と共培養することで、in vitro歯周病モデルを作製した。まず、ヘマトキシリン・エオシン染色を行い形態を観察した結果、Pg菌群において上皮層の厚みが増大していたが、細胞間並びに層間に多くの間隙が認められた。このモデルの上皮細胞を摘出した後にRNAを抽出し、マイクロアレイ解析を行った。その結果、細胞増殖に関連する遺伝子群の発現量が上昇し、細胞間接着に関わる遺伝子群の発現量が減少していた。特にE-カドヘリンについて抗体を用いて免疫組織染色を行った結果、E-カドヘリンの発現がPg菌群で有意に低下していた。また、細胞増殖マーカーであるKi67についても抗体を用いて免疫組織染色を行った結果、Ki67陽性細胞数がPg菌群で有意に増加していた。
Pg菌を共培養した3次元モデルに対する非選択的TRPチャネル阻害剤の作用を検討した結果、Pg菌群でみられた上皮層の厚みの増大が阻害剤によって抑制された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

3次元培養系モデル並びに歯周病モデルの作製を行い、モデルにおける上皮細胞の変化を明らかにすることができたため。また、歯周病モデルにおけるTRPチャネルの役割を示唆する結果を得られたため、順調に進展していると考えられる。

Strategy for Future Research Activity

Lucifer Yellow並びにFITC-デキストラン等を用いて上皮バリア機能を評価する。
OKF細胞の分化並びに細胞間接着に対する各TRPチャネルの活性薬もしくは阻害薬の作用を検討する。また、TRPチャネル発現量の変化をリアルタイムRT-PCR法並びにウエスタンブロット法を用いて検討する。また、遺伝子導入によるTRPチャネル過剰発現、siRNAによるノックダウンによるTRPチャネル発現量の違いと分化並びに細胞間接着の関係を検討することで、TRPチャネルの役割を明らかにする。

Causes of Carryover

TRPチャネル発現量変化、TRPチャネル遺伝子発現操作を次年度に実施することとなったため、次年度に使用することとした。