2018 Fiscal Year Research-status Report
変形性顎関節症の新規治療法の開発を目指したLubricinの発現調節機構の解明
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18K09769
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
栗尾 奈愛 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部, 助教 (80622141)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
福田 直志 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 助教 (10804156)
宮本 洋二 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 教授 (20200214)
中川 貴之 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 助教 (30456230)
高丸 菜都美 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 徳島大学専門研究員 (40513031)
大江 剛 徳島大学, 病院, 講師 (60432762)
真野 隆充 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 准教授 (80325125)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | Lubricin / TGF-β1 / 遺伝子改変マウス / 顎関節 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
変形性顎関節症(TMJ-OA)は顎関節を構成する骨軟骨の破壊を特徴とし、関節痛や開口障害により患者のQOLを低下させる。これまで変形した関節を修復させる根本的治療法は確立されておらず新規治療法の開発が望まれるが病態が不明であることが多く発症機序の解明が必要である。
Lubricinは滑液中に含まれるプロテオグリカンでPRG4遺伝子によってコードされる。軟骨面の摩擦抵抗を軽減し、軟骨を保護している。四肢関節ではTGF-βがLubricinの発現に重要であるとされており、本研究では顎関節のLubricin産生におけるTGFの役割と分子調節機構の解析を目的とした。これにより、TMJ-OAの発症機序の一因を明らかとし、予防法や新規治療法の確立を模索する。
平成30年度はPRG4プロモーターの制御下において蛍光mCherryを発現するレポーターマウスの顎関節から単離した細胞を用いて各種の実験を行った。単離後の細胞を種々の濃度のTGF-β1で処理した際のPRG4遺伝子の発現量の違いをreal-time PCR、RT-PCRで確認を行った。関節最表層から単離された細胞（SF細胞）のみがTGF-β1刺激により遺伝子発現の促進が認められた。それよりも下層の軟骨細胞では遺伝子発現は認めなかった。PRG4遺伝子発現にはTGF-β1によりリン酸化されたSMAD2/3が重要であり、これらの阻害剤でPRG4の遺伝子発現を抑制できることをウェスタンブロットにて確認した。さらにレポーターマウスから下顎頭軟骨を摘出し器官培養を行いTGF-β1で処理した結果、PRG4遺伝子の発現は顎関節の最表層でのみ発現が認められた。またALK5、SMAD2/3の阻害薬で処理するとPRG4の遺伝子発現は完全に抑制され、TGF-β1によるPRG4遺伝子発現はALK5を介したSMAD2/3シグナルが重要であることが確認された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成30年度はPRG4プロモーターの制御下において蛍光mCherryタンパクを発現するPRG４レポーターマウスの顎関節から酵素処理により単離した細胞を用いて各種の実験を行った。単離後の細胞を種々の濃度のTGF-β1で処理した際のLubricinの発現量の違いをreal-time PCR、RT-PCRで確認を行った。関節の最表層から単離された細胞のみがTGF-β1刺激によってLubricinの遺伝子発現の促進が認められた。それよりも下層の細胞ではLubricinの遺伝子発現は認められなかった. またLubricinの遺伝子発現にはTGF-β1によりリン酸化されたSMAD2/3が重要な役割をになっており、これらの阻害剤を用いることによりLubricinの遺伝子発現を抑制することをウェスタンブロットにて確認した。さらにPRG4レポーターマウスから下顎頭軟骨を摘出し器官培養を行いTGF-β1で処理してin vivoでのPRG4の発現を見た。その結果、PRG4遺伝子の発現はin vitroの実験と同様に顎関節の最表層でのみ発現が認められ、TGF-β1刺激によりPRG4遺伝子の発現が促進された。またALK5, SMAD2/3の阻害薬で処理することによりPRG4の遺伝子発現は完全に抑制されたことからTGF-β1によるPRG4遺伝子発現はALK5を介したSMAD2/3シグナルが重要な働きを担うことが確認された。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後はPRG4CreERT2マウスとTGF-βR2flox/floxマウスを交配しLubricin産生細胞特異的なCKOマウスを作製し、H-E染色、Safranin-O/Fast Green染色等を用いて顎関節を形態学的に解析する。 同マウスの顎関節におけるPRG4遺伝子やLubricinタンパクの発現をin situ hybridization、 免疫組織学的染色を用いて染色し、TFG-βシグナルの減少がLubricinの発現に影響を与えるかin vivoで確認する. またALK5受容体がPRG4遺伝子の発現に重要であることがこれまでの研究で明らかにできたため、ALK5flox/floxマウスを用いたマウスをもちいてのCKOマウスを作製することでより特異的な表現系を得られる可能性がありあるため、同マウスを用いた実験系も検討中である。
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| Causes of Carryover |
次年度の動物実験を一括して行うこととなり、次年度使用が生じた。次年度請求分と合わせて使用する
予定である。
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