2018 Fiscal Year Research-status Report
遺伝子工学的手法による乳歯歯髄細胞からの体性幹細胞単離とその特性解析
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18K09839
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| Research Institution | Kagoshima University |
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Principal Investigator |
稲田 絵美 鹿児島大学, 医歯学域附属病院, 講師 (30448568)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐藤 正宏 鹿児島大学, 総合科学域総合研究学系, 教授 (30287099)
齊藤 一誠 新潟大学, 医歯学系, 准教授 (90404540)
野口 洋文 琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (50378733)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 遺伝子工学的手法 / 乳歯歯髄幹細胞 / 体性幹細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、乳歯歯髄細胞（HDDPC）由来の体性幹細胞（somatic stem cell, SSC）を再生医療に応用することを最終目標に据え、HDDPCに含まれる幹細胞特異的マーカー発現SSCを、その特性を温存しながら遺伝子工学的手法で単離・濃縮し、単離株を分子生物学的に解析することにより、HDDPC由来SSCの実体を解明することを目的とする。
実施計画は、① HDDPCへの不死化遺伝子（テロメア逆転酵素遺伝子など）導入による細胞不死化株の樹立、② 遺伝子工学的手法によるHDDPC由来SSCの単離・濃縮、③ 単離株のマイクロアレイ解析などによる遺伝子発現様式の比較解析、④ 単離株の多分化能性、⑤iPS細胞誘導能などの細胞機能解析、などの検討から、HDDPCに含まれるSSCの実体を明らかにする。
具体的には、HDDPCへの不死化遺伝子導入により細胞不死化株を樹立すると同時に、OCT3/4、SOX2、NANOGなどの幹細胞特異的遺伝子のpromoter [遺伝子発現制御領域で、下流側にある遺伝子（蛋白をコード）の発現を促す] を内蔵したpiggyBac（PB）系トランスポゾンベクターの構築とその作動性試験を行い、細胞不死化株に当該ベクターが導入された安定株の取得を目指す。さらに、安定株間の幹細胞特異的遺伝子発現様式の比較解析、多分化能性や山中4因子導入によるiPS細胞誘導性に関する機能試験を行い、安定株間の違いや近似性を明らかにする。
平成30年度にはPBトランスポゾンベクターにテロメア逆転酵素（telomerase reverse transcriptase, TERT）遺伝子発現ユニットもしくはE7遺伝子（ヒトパピロマーウイルスHPVのE7蛋白をコード）を組み込んだ不死化用ベクターをHDDPCへ導入し、不死化HDDPC株を取得した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成30年度は、２種類の不死化用PBトランスポゾンベクターpT-E7（E7遺伝子を搭載）とpT-hTERT（ヒトTERT cDNAを搭載）を作製し、他のマーカー遺伝子搭載のPBトランスポゾンベクター（pT-pac + pT-tdTomato or pT-EGFP）+ transposase発現ベクターpTransと共に、Neon electroporation systemにてHDDPCへ遺伝子導入した。その後、薬剤選択により出現コロニーを拾い上げ、株化した。最終的にpT-E7由来の株は2個、pT-hTERT由来の株は3個得た。これら株について親株と差があるか検討した。いずれも、プラトーに達した後の細胞増殖の停止（細胞接触阻害）を認めた。また、同程度のALP活性、OCT-3/4、SOX2、NANOG, NESTINの発現を認めた。更に、いずれも、in vitroにおいて神経や骨細胞へ分化する能力を維持していた。
一方、HDDPCの不死化による細胞の癌化（悪性化）の可能性についても検討した。癌細胞は細胞外基質に接着しなくても、生存・増殖する（「足場非依存性増殖」）。不死化HDDPC株を寒天上（足場がない状態での培養）で培養すると、増殖不能であった。一方、悪性腫瘍の一つマウスF9 teratocarcinoma cellsは増殖を継続させた。さらに、in vivoで造腫瘍性を検討した。iPS細胞をヌードマウス膵臓内に移植すると、その細胞が少数（~100）でも移植細胞は腫瘍塊（teratoma）を形成することを我々は既に見出していた。このin vivoの系を用い不死化HDDPC株をヌードマウス膵臓内に移植したが、1.5ヶ月を経ても固形腫瘍の形成を認めず、同細胞株は悪性化していないだろうと考えた。
以上の結果から、「親株の特性を保持したまま細胞の不死化に成功した」と考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成３１年度は、各種幹細胞特異的遺伝子promoterの下流に、EGFP（緑蛍光蛋白）cDNA + poly(A)付加部位 + neomycin耐性遺伝子発現ユニット（neo）を内蔵する3種のPB系ベクター、いわゆる、pT-SOXEN（SOX2 promoter搭載）、pT-NANEN（NANOG promoter搭載）、pdOEN（Oct-3/4 promoter搭載）を構築する。当該ベクターの作動性を判定すべく、Oct-3/4、Sox2、Nanogを恒常的に発現するマウスF9細胞（未分化なteratocarcinoma cells）にこれらベクターを遺伝子導入する。遺伝子導入後、2～4日目に細胞を回収し、EGFP由来緑蛍光発現の有無を調べる。緑蛍光が確認された場合、用いたベクターは正しいと判断される。緑蛍光を発しない場合、用いたpromoterに不具合があるので、promoter自体の塩基配列、promoterとEGFP間の結合部位の塩基配列をsequencingにより調べる。
次に、不死化HDDPC株へpT-dOEN + pTrans（transposase発現ベクター）、pT-SOXEN + pTrans、あるいはpT-NANEN + pTransを遺伝子導入する。遺伝子導入後、4日目に細胞を回収。細胞をneomycin analogueであるG418を含む培地に播種し、培養する。生じた薬剤耐性コロニーを拾い、拡大。最終的にそのコロニー由来の安定株を得る。その後、各種特性解析へと実験を進める。
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| Causes of Carryover |
平成３１年度以降は細胞の特性解析の機会が増える見込みである。そのため、次年度使用額として翌年度分に助成金を請求した。
次年度の研究費使用計画は以下の通りである。物品費：細胞培養用試薬、分子生物学用酵素等の消耗品、旅費：日本小児歯科学会、歯科基礎医学会学術大会の参加と研究打ち合わせ、謝金：研究補助の謝金、その他として細胞解析の外注、論文校正料、投稿料を計上した。
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