Molecular mechanism of hypoxia-induced modification of cytokine cascade in periodontal ligament cells

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18K09846
• Research Institution: Nihon University
• Principal Investigator: 白川 哲夫 日本大学, 歯学部, 教授 (00187527)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 低酸素暴露 / 歯根膜細胞 / DNAメチル化 / DNA脱メチル化 / CpG / サイトカイン / ビーズアレイ

Outline of Annual Research Achievements

【研究方法】　ゲノムDNAの調製およびDNAメチル化解析：　不死化ヒト乳歯由来歯根膜細胞SH9を試料に用い、通常条件（5% CO2、95% air、 37℃）または低酸素条件（5% CO2、O2: 1％未満あるいは5％、37℃）で培養したのちゲノムDNAを回収した。回収したゲノムDNAについて、イルミナ社ビーズアレイを用いてDNAメチル化解析を行った。本年度は、低酸素環境に暴露したのち、通常条件にもどして一定期間培養後にゲノムDNAの回収を行い、低酸素暴露により一部の遺伝子で生じたDNAメチル化レベルの変化がどのくらいの期間維持されるかについて検討した。低酸素暴露時間は12時間または24時間とし、24時間暴露群については1週あるいは4週の通常培養を追加実施した。
【成果】1) ビーズアレイを用いて網羅的にDNAメチル化解析を行った結果、O2濃度1％未満で培養した直後にDNAを回収した群が、約865,700箇所検出されたCpG全体としてみた場合、最もメチル化シグナル値が低かった。脱メチル化を生じたCpGを個別にみた場合、24時間低酸素暴露してもほとんどは1週間の通常下培養後には暴露前のメチル化率に戻っており、低酸素暴露の影響は、それが細胞の生存にとって非常に厳しい条件（O2濃度1％未満）であっても、1週間以内に消失することが明らかになった。
2) 5% O2という比較的マイルドな低酸素培養条件では、これまで実施した研究で少数の遺伝子についてmRNA発現が促進されることを示唆する結果を得ていたが、ビーズアレイによる今回の検討では、24時間培養した場合でも、直後のメチル化率についてほとんど通常下培養の結果と同レベルであった。これらの結果から、低酸素暴露が直接的にCpGのメチル化に変化を生じさせるためには、O2を5％より低くして24時間またはそれ以上暴露する必要があると考えられた。