2019 Fiscal Year Research-status Report
舌下粘膜組織に存在する免疫細胞クラスターの口腔免疫応答における役割の解明
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18K09930
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| Research Institution | Osaka Ohtani University |
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Principal Investigator |
楠本 豊 大阪大谷大学, 薬学部, 准教授 (40252689)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
戸村 道夫 大阪大谷大学, 薬学部, 教授 (30314321)
片岡 宏介 大阪歯科大学, 歯学部, 准教授 (50283792)
守屋 大樹 大阪大谷大学, 薬学部, 助教 (30759759)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 舌下免疫 / 樹状細胞 / クラスター |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、舌下粘膜に存在する樹状細胞（DC）のクラスターに着目して、舌下領域における免疫制御、さらには舌下粘膜の全身免疫系における役割について理解し、より効果的なワクチンや舌下免疫療法につなげることを目的としている。そのために免疫応答の初期誘導に重要な働きを担っているDCの口腔内分布の詳細な解析を行い、部位特異的なDC分布を示してきた。特に定常状態のマウスの舌下粘膜面にはDCの集積すなわちクラスターについて、その性状を詳細に解析した。舌下面のクラスターに含まれるDCのサブセットも同定し、さらにCD4+, CD8+T細胞が含まれることも確認している。これらの内容の一部は第60回歯科基礎医学会総会で発表した。さらに、抗原投与を行うことによるクラスター形成への影響を検討した。舌下面にジニトロフルオロベンゼン（DNFB）もしくは卵白アルブミン（OVA）を抗原として投与することで、顕著にクラスター形成を誘導できることを見いだし、抗原の投与スケジュールによるクラスター形成の差異も確認している。このスケジュールの検討から、強いクラスター形成は2次免疫応答が必要であることや、クラスター形成におけるT細胞の役割を示唆するデータをいくつか得ている。また、クラスターにT細胞が含まれることから、クラスター内のT細胞を詳細に解析するために、当初計画書には記載していなかった遺伝子改変マウスの作成や、骨髄キメラマウスを作成することによるクラスター細胞の解析の実験系の開発も行った。また、舌下免疫療法の機能解析を想定して、抗原特異的なIgEの誘導とその検出系を立ち上げている。抗原投与によるクラスター形成に関する結果は、第61回歯科基礎医学会総会で発表した。この様に、当初計画書の記載した実験に加え、新たに有効な実験手法を立ち上げながら研究を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
進捗からすれば、申請時予定していた方針を概ね進められていると考える。しかしながら、以下の2点は当初予定していたこととは異なった実験手法でクラスターの役割ならびに形成過程を解析することに変わってきている。１点目の手法の変更は、遅れを来しているとは言え、より詳細に目的達成出来ると考え、むしろ変更が望ましかったと考えている。さらに、舌下免疫療法を想定した実験にも着手し出している事から、「概ね順調」と判断している。
１．申請当初、免疫細胞集積のメカニズム解析の目的で、組織切片よりクラスター部をマイクロダイセクターで採取後、mRNAを抽出し、遺伝子解析を行う事が昨年度実施する予定だった。しかしながら、キメラマウスを用い、生きたクラスター構成細胞のみをマウス舌下組織から単離する実験系を開発出来たため、クラスター構成細胞のサブセットを検討できるようになったことと、このサブセット毎に単一細胞レベルで遺伝子解析が可能となってきた。現在、舌下粘膜に抗原投与し、形成されたクラスターからDCやT細胞のサブセットを単離し、そこからｍRNA抽出を行うことを試みようとしている。mRNAの抽出、解析という点では、当初の計画より遅れを来しているが、むしろより詳細な解析が出来る確信を得ている。
２．Ca2+ biosensor transgenicであるYC3.6マウスと抗原として用いる卵白アルブミン特異的T細胞受容体のtransgenicであるOT-IIマウスの掛け合わせマウスの作成を予定していたが、作成できなかった。この代替案として、細胞周期を可視化できるFucciマウスを用いて、クラスター内のT細胞活性化を検討することを考えている。Fucciマウスは当講座で保有しており、OT-IIマウスとの掛け合わせも可能と考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
基本的には申請時に計画した目的達成に向かって推進させたい。昨年度の本研究実施状況報告書では、光変換タンパク質KikGRをDCのみに発現させたCD11c-KikGRマウスを用いたDCサブセットの詳細解析を記載した。この系ではクラスター内のDCサブセットの解析が出来るが、逆に言えばDCのサブセットしか解析出来ない。そこで、放射線照射した野生型マウスに、全身の細胞でKikGRを発現するKikGRマウスの骨髄細胞を移入した骨髄キメラマウスを作成し、舌下面のクラスターのみに共焦点レーザー顕微鏡のRegion of interest (ROI)の機能を用いて紫光を照射することにより、クラスターを構成する全ての骨髄由来細胞の蛍光を緑から赤に変えることが出来た。すなわちDC以外のクラスター構成細胞、特にT細胞の詳細解析が可能となる。このマウス作成と実験系が確立できたので、申請時に記載した以上により詳細なクラスターの解析を行えることになった。
また、CD11c-YFPマウスと、制御性T細胞(Treg)がヒトCD2を発現するFoxp3-hCD2マウスの掛け合わを行い、クラスター内のTregの存在を免疫組織染色で可視化できるようになった。申請書に記載したCD11c-YFPマウスの舌の組織染色や透明化サンプルの観察に加え、同マウスの観察を行うことでクラスター内のTregの存在を検出することが出来る。さらに、舌下免疫療法の機能解明を想定したOVA特異的IgE検出のためのELISA法、ELISPOT法も確立できている。
この様に、昨年１年間は、より詳細な解析が可能となる実験系の作成を行ってきた。これらマウスや検出系を用いながら、申請書に沿った研究を遂行して行く予定である。
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| Causes of Carryover |
「現在までの進捗状況」で記載したとおり、マイクロダイセクターで得た組織からmRNA抽出を予定したが、より詳細な情報が得られると考えられる実験系を開発出来たので、mRNA抽出、解析の一連の実験を本年度に行うこととした。そのために予算の一部を次年度に繰り越しし、mRNAの抽出、解析に本年度使用する予定である。
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