母乳に含まれるビタミン候補物質ピロロキノリンキノンの高感度分析法の開発とその応用

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K11059
• Research Institution: Seirei Christopher University
• Principal Investigator: 熊澤 武志 聖隷クリストファー大学, 看護学部, 教授 (00186470)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 久保田 君枝 聖隷クリストファー大学, 助産学専攻科, 教授 (40331607) ; 李 暁鵬 (中内暁博) 昭和大学, 医学部, 准教授 (90245829)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: ピロロキノリンキノン / 母乳 / 固相抽出法 / MS法

Outline of Annual Research Achievements

本年度は以下の検討を行った。
1)安定同位体 [13C]PQQの合成と精製：内部標準物質として使用する [13C]PQQは、安定同位体[13C]メタノールから発酵法によって合成した。純度検定は高速液体クロマトグラフィー（HPLC）/質量分析（MS）法を用いて確認したところ、 [13C]PQQは約60％、d体化されないPQQが約40％確認され、合成の再検討の必要性が明らかとなった。
2)PQQ標準品のUPLC分離条件の検討：分析対象のPQQ標準品について、UPLCの分離条件の検討を行った。分析カラムはHILICカラム（アミド基、アミノプロピル基、ジヒドロキシプロピル基）、順相カラム（ジオール、シリカゲル及びシアノプロピル系）、逆相系（C18、C8、C4）の種々のカラムを検討した。その結果、PQQの分離は、逆相系の C18あるいはC8カラム（長さ150mm x 内径2.0mm、粒径5μmあるいは3μm）の使用が比較的良好であった。また、移動相はアルカリ性溶媒とアセトニトリルを用いることで、比較的シャープなPQQピークが短時間に分離することができた。
3)マススペクトル解析の検討：本研究では、PQQ標準品のUPLC/タンデム質量分析（MS/MS）-エレクトロスプレー法によるマススペクトル解析を行った。MSでは脱プロトン分子をベースピークとし、MS/MSでは特徴的な開裂に伴うプロダクトイオンが出現する共通性が見られ、結果をまとめてスペクトルライブラリーを作成した。また、この結果を基に、UPLC-MS/MSによる選択反応モニタリング（SRM）法を設定したところ、PQQが感度良く検出された。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

本年度は安定同位体[13C]PQQの合成と精製を行ったが、予定していた純度を得ることができなかった。この[13C]PQQ合成の精製過程は最適と思われることから、発酵法による合成法を再検討する必要がある。また、授乳婦からの母乳の採取を行う予定であったが、施設及び授乳婦の選定が難航してしまい、次年度以降の実施となった。

Strategy for Future Research Activity

本年度に検討した内容を参考に、今後は微量固相抽出（SPE）法とUPLC-MS/MS法を組み合わせた新しいPQQの分析法を開発し、授乳婦から得られた母乳からPQQを検出・定量する予定である。特に、本年度に終了できなかった内部標準物質の安定同位体[13C]PQQの合成と精製は、純度を高める方法を再検討する必要がある。しかし、[13C]PQQの純度が一定以上得られない場合は、PQQと類似の構造あるいは化学的性質を有する薬物（化学物質）を内部標準物質として選定する方法に変更することも視野に入れ、次年度からその選定を行う予定である。微量SPE法に関しては、現在開発中のシリカモノリスSPE法をPQQの抽出に用いる予定であり、開発後に、この微量SPE法を母乳中PQQの抽出に応用する予定である。また、母乳は採取が少量で貴重であることから、ミリQ水あるいは人工乳（粉ミルク）を用いた添加実験によって微量SPE法の条件設定を実施する予定である。特に、徐タンパク法、洗浄溶媒並びに溶出溶媒の選択、回収率、再現性等の検討を行い、最適な抽出条件を設定する。さらに、微量SPE法とUPLC-MS/MS法の組み合わせた分析システムによる母乳中PQQ分析の日内変動率及び日間変動率を指標とした再現性の検討、検出限界及び検量線の作成による定量性の検討等を行い、本分析システムの品質管理を行う。その後、授乳婦から母乳の提供を受け、本研究で確立した分析システムを用い、母乳からのPQQの同定と定量を行う予定である。

Causes of Carryover

本年度の当初計画である安定同位体[13C]PQQの合成と精製は目標の純度に達することができなかった。また、PQQの分離分析法及び微量SPE法の検討が十分に行うことができなかったほか、授乳婦からの母乳の採取を行わなかったことから卓上型超低温槽の購入を見合わせた。その結果、研究費の次年度使用が発生した。次年度に使用する研究費としては、卓上型超低温槽のほか、消耗品費の主なものではUPLC分析カラム（253,000円）、固相抽出カートリッジ（106,000円）、ガラス器具としてオートサンプラー用の小型バイアル瓶、試験管、ビーカー及びフラスコ等、プラスチックチューブ及びバイアル瓶等が含まれる（80,000円）。なお、次年度から内部標準物質として適した薬物（化学物質）の検討を安定同位体[13C]PQQの合成と精製と平行して行う予定であることから、分析に必要な試薬類（152,000円）に加え、薬品類（134,000円）を追加購入する。さらに、母乳提供者への謝金（20人分、240,000円）が使用予定額に含まれる。