母乳に含まれるビタミン候補物質ピロロキノリンキノンの高感度分析法の開発とその応用

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K11059
• Research Institution: Seirei Christopher University
• Principal Investigator: 熊澤 武志 聖隷クリストファー大学, 看護学部, 教授 (00186470)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 久保田 君枝 聖隷クリストファー大学, 助産学専攻科, 教授 (40331607) ; 李 暁鵬 (中内暁博) 昭和大学, 医学部, 准教授 (90245829)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: ピロロキノリンキノン / 母乳 / 抽出法 / 質量分析法

Outline of Annual Research Achievements

本年度は以下の検討を行った。
1) 新規のシリカモノリスSPEであるスピンチップSPEを用いたPQQ抽出条件の検討を行った。スピンチップに充填するシリカモノリス固相ゲルはC18を用いた。PQQは塩酸水溶液との混液でスピンチップSPEにロードした後、ピリジン溶液によって溶出した。溶出液は蒸発乾固後、その残渣を移動相で溶解しHPLC分析に供した。その結果、回収率は約85％、日内変動（CV値）は5％前後であった。また、人工乳（粉ミルク）を用いたPQQ添加実験では、塩酸水溶液を加え遠心分離した後、その上清をスピンチップ固相にロードした。回収率は約40％、CV値は15～22％であった。
2)イオン交換樹脂を用いたSPEの抽出条件の検討を行った。PQQはリン酸水溶液との混液でSPE固相にロードした後、トリフルオロ酢酸/メタノール溶液でPQQを溶出した。その結果、HPLC分析では、回収率が約80％、CV値が7％前後であった。また、人工乳を用いたPQQ添加実験では、生後1か月の乳児が摂取するタンパク量に調整した人工乳0.1mLに対して、リン酸水溶液を加え遠心分離を施した後、その上清をSPE固相にロードした。HPLC分析では、回収率が約50％、CV値が10～17％であった。
3) PQQを人工乳に添加したSPE抽出物について、UPLC/MS/MS-ESI法による分析条件を検討した。SRM測定の最適条件の検討では、脱プロトン化イオンと複数のプロダクトイオンとの組み合わせから、カルボキシ基の開裂によるm/z 241および脱水イオンm/z311の選択したところ、イオン強度およびバックグランドノイズの観点から良好な条件であることが明らかとなった。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

人工乳を用いたPQQ添加抽出実験において、シリカモノリススピンチップSPEへの通液性と抽出効率の低さが課題となっている。通液性はシリカモノリス固相のスルーポア径を広げることで改善することができたが、抽出効率が低下してしまった。また、塩酸水溶液による除たんぱく処理は、遊離PQQの上清への回収率を減少さる結果となってしまった。さらに、イオン交換樹脂SPEでは、抽出処理がC18固相に比べ煩雑であり、現在までに最適な母乳中PQQの迅速抽出条件は決定するまでには至っていない。一方、新型コロナウイルス感染の影響によって、授乳婦からの母乳の採取について、施設および授乳婦の選定、採取方法の検討等について進捗が遅れているほか、研究代表者（静岡都）が研究分担者（東京都）の施設に出向いて、設置されている分析機器類を使用することができないため、データ採取が遅れている。

Strategy for Future Research Activity

次年度は、これまでに検討した内容を基に、微量抽出法とUPLC-MS/MS法を組み合わせた新しい母乳中PQQの分析法を構築し、授乳婦の母乳からPQQを検出・定量する予定である。また、本年度に終了できなかった内部標準物質の選定は、安定同位体あるいは類似の化学構造を有する薬毒物から行う予定である。さらに、微量抽出法に関しては、シリカモノリススピンチップSPE法あるいはイオン交換樹脂を用いたSPE法の中から母乳中PQQの迅速抽出が可能な最適な方法を選択する。この抽出法に関しては、最近、いろいろなカクテルによる分離技術と高感度MS法との組み合わせが報告されている。特に、徐タンパクはSPE法よりも液-液抽出法の方が処理効率は高く、回収率、再現性等の検討も同時に進める中で、最適な母乳中PQQの抽出法を決定する。抽出法の改善によって、UPLC-MS/MS法でのイオン強度の低下現象も改善され、本分析システムの品質管理が効率よく進むと思われる。最終的には、本研究で確立した分析システムを用い、授乳婦から提供を受けた母乳についてPQQを同定・定量するほか、分析結果と母乳提供者の栄養状況あるいは授乳状況をふまえた本研究の栄養学領域での有用性等を検討する。

Causes of Carryover

本年度の当初計画である人工乳を用いたPQQ添加実験における抽出法並びにUPLC-MS/MS-ESI法によもが遅れていることから、研究費の次年度使用が発生した。次年度で充当する消耗品費等の主なものとしてUPLC分析カラム（66,000円）、SPEカートリッジ（58,000円）、試薬類（51,000円）を購入するほか、母乳提供者への謝金（20人分、240,000円）が含まれる。