Development and application of a highly sensitive analytical method for pyrroloquinoline quinone (PQQ) as a candidate vitamin contained in breast milk

2023 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18K11059
• Research Institution: Seirei Christopher University
• Principal Investigator: 熊澤 武志 聖隷クリストファー大学, 看護学部, 教授 (00186470)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 久保田 君枝 聖隷クリストファー大学, 助産学専攻科, 教授 (40331607) ; 中内 暁博 東都大学, 沼津ヒューマンケア学部, 教授 (90245829)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: ピロロキノリンキノン / 母乳 / 抽出法 / 質量分析法

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、母乳中のピロロキノリンキノン（PQQ）について、その分離分析法の開発とヒト母乳からの高感度検出法の開発を検討した。PQQ標準品を用いたUPLCの分離条件の検討では、分析カラムはHILICカラム、順相カラム、逆相系の種々のカラムの有用性を試みたが、逆相系ODSカラム（長さ150mm x 内径2.0mm、粒径5μm）が最適であることが明らかとなった。また、UPLCの際の移動相は酢酸アンモニウム水溶液をベースにしたアセトニトリルのリニアグラジエント法を用いることで、比較的シャープな目的ピークが短時間に分離することができた。さらにODSカラムは、人工乳の抽出物を用いた分析にも応用可能であった。UPLC/タンデム質量分析（MS/MS）-エレクトロスプレー法（負イオンモード）によるPQQのマススペクトル解析を行ったところ、MSではm/z329の脱プロトン分子をベースピークとし、MS/MSではカルボキシ基の開裂によるプロダクトイオンm/z285や241（ベースピーク）などが出現した。この結果から、SRM法ではm/z329をプリカーサーイオンとしたm/z241との組み合わせを用いることで、1～250ngの範囲で良好な検量線が得られた。人工乳を用いた抽出法の検討では、QuEChERS法による液-液抽出は簡便な操作であるものの、回収率は数％の低さであった。一方、ODS及びイオン交換樹脂カートリッジカラムを用いた固相抽出では、人工乳を除タンパク処理を施した後、カラムへのロード、洗浄、溶出を試みたところ、50～70%の回収率が得られた。本法をヒトの母乳に適用したところ、PQQが検出されたことから、今回開発された高感度分離分析法は、ヒト母乳中のPQQ検出に応用できることが明らかとなった。