2018 Fiscal Year Research-status Report
Novel acitivation mechanizm of ATR-ATRIP kinase upon DNA replication stress
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18K11642
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| Research Institution | National Cancer Center Japan |
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Principal Investigator |
石合 正道 国立研究開発法人国立がん研究センター, 研究所, 施設長 (90298844)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | DNA損傷応答 / DNA修復 / フォーカス形成 / ATRIP / ATR |
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| Outline of Annual Research Achievements |
放射線などにより生じるゲノム損傷は生体にとり有害であるため、生体にはその防護機構としてDNA損傷応答機構が存在する。その中心分子はATMとATRキナーゼであるが、本課題ではATRに注目した。ATRはATRIPと複合体を形成し、DNA複製ストレスで活性化され、これまで少なくとも2つの活性化機構が知られている。
研究代表者はATR-ATRIPの活性化機構が他にも存在するのではないかと考え、新たなATR-ATRIP活性化機構を解析する目的で、ATRIP-GFPを安定に発現するヒトA549細胞を用い、DNA複製ストレス下でのATR-ATRIP活性化の検出系を構築した。具体的には、複製ストレス条件下で、ATR-ATRIP活性化をATRIP-GFPのフォーカスとして、複製ストレスの初期反応を反映する1本鎖DNAの生成をその部位に結合するRPAフォーカスとして検出する系を構築した。この系を用い、複製ストレスを与えるマイトマイシンC（MMC）24時間処理で、siRNAライブラリースクリーニングによってATRIP, RPAそれぞれのフォーカス形成効率に影響する数十個の候補分子を得た。
1次スクリーニングの条件として用いたMMC 24時間処理では、厳密に考えるとRPA活性化が複製ストレスの初期反応を含めた複数の段階で起こっている可能性を排除できない。このため、複製ストレスの初期反応としてのRPA活性化を反映するよりシンプルな条件で候補分子の表現型を再現できるか、検討する必要があると考えた。このため本年度はMMCとは異なるヒドロキシウレア（HU）2時間処理で再検討を行った。この結果、候補分子の数をさらに絞り込むことができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
計画していた別の複製ストレス処理、具体的にはHU2時間処理による2次スクリーニングを予定通り終了できた。今後、候補分子の個別の解析を行うために発現プラスミドの作成、siRNAや抗体などの実験材料の入手を適宜すすめている。なお、本研究課題の開始前に研究代表者の所属先の異動があり、異動先での研究環境のセットアップに少し時間を要した。
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| Strategy for Future Research Activity |
候補分子の発現プラスミドの構築と細胞内局在、相互作用の検討。2次スクリーニングで残った候補分子について、個別にｃDNAを入手しタグ付きの発現プラスミドを構築し、発現細胞における複製ストレス下での細胞内局在やフォーカス形成、ATRIP-GFPならびにRPAとの共局在を検討する。
候補分子のノックダウン細胞の樹立と表現型解析。個別の候補分子に対し、siRNAを用いたノックダウン細胞やCRISPER/Cas9システムによるノックアウト細胞を構築する。樹立した細胞株を用い、DNA損傷応答やDNA修復の表現型解析を行う。まず、様々なDNAダメージに対する感受性試験を行い、どのようなDNA損傷に感受性を示すかその傾向を把握する。さらにダブルノックアウト細胞を構築し、遺伝学的検討により既存のDDRや修復経路との関係を明らかにする。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額が生じた理由。研究は順調に推移しているが、研究材料の取得が見込みより遅れ気味であり、結果的に今年度の研究費に余裕が生じた。
使用計画。主に消耗品に使用する。
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