2018 Fiscal Year Research-status Report
DNA二本鎖切断同士のペアリングを制御する分子ネットワークの解明
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18K11645
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
山内 基弘 長崎大学, 原爆後障害医療研究所, 助教 (60437910)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | Chromosome rearrangement / DNA double-strand break |
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| Outline of Annual Research Achievements |
放射線被ばくによって起こる最も重大なゲノム変化のひとつにChromosome rearrangement（CR）があるが、その生成・生成抑制の分子メカニズムはよくわかっていない。CRはゲノム内の異なる領域に生じた2つのDNA二本鎖切断（DSB）のつなぎかわりによってできるため、CR生成には2つのDSBが動いて近接する「DSBペアリング」が必要である。しかしこのDSBペアリングについては、これまでほとんど報告がなかった。私は最近、γ線照射したヒト細胞でDSBペアリングを可視化する実験系を樹立し、Ku80, DNA-PKcs, ATM, 53BP1の4つの因子がDSBペアリングを制御していることを明らかにした（Yamauchi et al. Sci. Rep. 2017）。しかしこれら4因子以外にもDSBペアリング制御にかかわる因子が存在する可能性は高く、DSBペアリングの制御メカニズムの全容はわかっていない。そこで本研究では、新たなDSBペアリング制御因子をスクリーニングにより見つけ、どの因子がどの因子と協力しているかという、DSBペアリング制御の分子ネットワークまでを明らかにするのが目的である。2018年度はクロマチン関連因子についてsiRNAスクリーニングを行った。このスクリーニングにより、ヘテロクロマチン構成因子である、KAP1およびCHD3がDSBペアリングの頻度に影響を与えていることを明らかにした。このことからクロマチンの凝縮度がDSBペアリングに関与することが示唆される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画通り、2018年度は新たなDSBペアリング制御因子の探索のため、siRNAを用いたスクリーニングを実施した。DSBペアリングはDSBのまわりのクロマチンの動きによって起こるので、今年度は特にクロマチン関連因子に焦点を絞ってスクリーニングを行った。その結果、ヘテロクロマチン構成因子であるKAP1およびCHD3がDSBペアリングの頻度に影響を与えていることが明らかとなった。スクリーニングによりDSBペアリングにかかわる新規因子を2つ同定できたことから、進捗状況はおおむね順調と言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
2018年度のsiRNAスクリーニングにより、ヘテロクロマチン構成因子KAP1とCHD3がDSBペアリングの頻度に影響を与えていることが明らかとなった。そこで今後は、この2つの因子がどのようなメカニズムでDSBペアリングに関与しているのかを明らかにしたいと考えている。具体的には、KAP1, CHD3とすでにDSBペアリングに関与していることが分かっている、Ku80, DNA-PKcs, ATM, 53BP1との関係を調べる予定である。またこれまでの自身の科研費研究で確立してきた以下の2つのChromosome rearrangement (CR)定量システムを駆使して、KAP1やCHD3をノックダウンした細胞におけるCR生成頻度を定量する。
1)セントロメア・テロメアFISHによる、γ線照射後の二動原体染色体（CRの一種）定量システム
2)CRISPR/Cas9による癌関連融合遺伝子生成・定量システム
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| Causes of Carryover |
2018年度に購入を計画していた試薬の改良品が2019年度はじめに発売されるという情報を得たため、2018年度内での購入を控えた。
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