2018 Fiscal Year Research-status Report
1細胞DNA複製タイミング解析による発生分化過程の核内コンパートメント動態予測
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18K14681
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
高橋 沙央里 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, 基礎科学特別研究員 (80748856)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | DNA複製タイミング / 1細胞解析 / 細胞分化 / 核内構造 / scRepli-seq / エピゲノム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年開発されたHi-C法は、染色体ドメインTADや核内コンパートメントといったMb単位のクロマチン構造をゲノムワイドに解析できる。これを個々の細胞で解析するには1細胞Hi-Cを行う必要があるが、1細胞Hi-Cは解像度が低くTADやコンパートメント分布の算出が難しい。一方、最近我々は、培養細胞を用いた1細胞全ゲノムDNA複製タイミング解析法scRepli-seqの開発に成功した。DNA複製タイミングはコンパートメント分布と強く相関するため、scRepli-seqは1細胞レベルでコンパートメント分布を推定できる強力な方法である。本研究では、マウスのES細胞分化及び初期胚発生過程でscRepli-seqの経時的解析を行い、発生・分化に伴う三次元ゲノム構造変化を推定することを計画した。
本年度は、マウスES細胞分化後1週間、経時的（1日ごと）にscRepli-seqを行った。複製タイミングの全ゲノムプロファイルは分化に伴い徐々に変化し、SPRING解析（データ間ばらつきの解析手法）の結果、同じ日の細胞はほぼ全て１本の軌跡にきれいに乗ること、そしてその軌跡が分化に伴い一定方向に動く様子が観察された。即ち、分化細胞集団中の個々の細胞は、複製プロファイル、ひいては核内コンパートメントを徐々に変化させるが、変化の度合いはほぼ均一であることが示唆された（Miura et al, Nat Genet, in press）。
次に、マウス初期胚のscRepli-seq解析に取り組んだ。初期胚は細胞数が少なく、フローサイトメーターによるS期細胞の同定ができない。そこで、顕微鏡下でEdU陽性のS期細胞の同定を試みた。この実験は成功したが、研究の過程で、EdU染色せず、事後にscRepli-seqデータからS期細胞を同定する方が効率的と判明した。次年度は着床前胚のscRepli-seqを行う。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、(1)ES細胞分化誘導系におけるscRepli-seqと核内コンパートメント変化の推定、(2)顕微鏡観察によるMid-S細胞の同定方法の確立、(3)着床前胚のscRepli-seq、(4)着床後胚における三胚葉分化に伴うscRepli-seq、を順に行うことを計画している。現在までに(1)については達成しており、2報の論文にまとめることができた（Takahashi et al, Nat Genet 2019; Miura et al, Nat Genet, in press）。また、(2)については、(1)の研究の過程で、scRepli-seqを行う前にMid-S細胞の同定をしなくても、得られたシーケンスデータから細胞周期の時期を算出でき、どの細胞がMid-S細胞であるのかを事後に同定できることが分かったので、今後はこの事後同定法を採用する。現在は(3)に取り組んでおり、初期胚の割球1つずつからscRepli-seqを行う最適な実験条件を整えつつある。現時点では、非固定細胞の方が固定細胞に比べて高解像度scRepli-seqデータを得られること、細胞培養液の持ち込み量に応じてscRepli-seqの反応量を調整する必要があることなどが判明している。そのため、近いうちに胚発生に伴うscRepli-seq解析に本格的に移行できる見込みである。以上の通り、研究課題の進捗状況は、おおむね順調と考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は、マウス着床前の初期胚（受精後～3.5日目胚）を用いてscRepli-seqを行い、発生初期過程における複製プロファイルの動的変化を明らかにしたい。そのためには、まず、初期胚を用いたscRepli-seqを再現性よく行うプロトコールを確立する。実験プロトコールが確立できたら、初期胚の各割球を回収してscRepli-seqを行い、胚発生に伴う変化を観察する。着床前のこの時期には、受精後初めての分化、すなわち全能性細胞から胎仔系列（ICM/epiblast）と胎盤系列(TE)という2種類の細胞への枝分かれが起こるため、いつどのような複製プロファイルの変化が起こるのかを詳細に追跡する。研究計画では細胞種の同定は免疫染色により行うと提案したが、初期胚のscRepli-seqは非固定細胞で行いたいため、固定が必要な免疫染色ではなく、同一細胞からのscRepli-seqとsc(single-cell)RNA-seqの同時解析を行うことを検討している。scRNA-seqができれば、免疫染色よりも多くの遺伝子の発現情報を得られるという利点もある。また、今年度はES細胞分化前後の細胞を用いたscRepli-seq（in vitro）で複製ドメインの安定性やゆらぎが観察されたが、in vivoの初期胚ではそれがどのように観察されるのか、その共通点と差異を明らかにしたい。
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Research Products
(5 results)
