2018 Fiscal Year Research-status Report
抗原提示効率に関わるウイルス・宿主因子相互作用の解析
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18K15175
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| Research Institution | National Institute of Infectious Diseases |
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Principal Investigator |
関 紗由里 国立感染症研究所, エイズ研究センター, 研究員 (70758325)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | HIV / 宿主因子 / 抗原提示 / MHC-I |
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| Outline of Annual Research Achievements |
エイズワクチン戦略として細胞傷害性T細胞（CTL）誘導の有効性が示されているが、HIV複製抑制効果の高いウイルス特異的CTLを効率的に誘導するためには、ワクチン抗原の最適化が重要となる。抗原となるウイルスタンパクの中にはHIVの増殖過程で宿主因子との相互作用を介して機能するものが知られ、その作用自体はこれまでも薬剤標的として注目されてきた。本研究では新たに、ウイルス―宿主因子相互作用に付随する細胞内分解機構を経てウイルス抗原が細胞表面に提示される効率に着目し、宿主因子に関与するウイルスタンパクを発現させた細胞において、対応する宿主因子の有無で抗原提示の効率に差があるかを解析することを目的としている。本研究はこれまで知られていなかったウイルス抗原提示に対する宿主因子の影響を解明し、特定のウイルスタンパク抗原提示を促進させることによる感染防御機構の増強という新しい戦略の起点となることが期待される。
本年度は、MHC-I分子発現細胞株の樹立とウイルスタンパク発現ベクターの構築を行った。まずMHC-I分子発現ベクターを構築し、これを用いて目的のMHC-I分子を恒常的に発現する細胞株を樹立した。使用する細胞株については、発現している宿主因子の種類と量の検討を踏まえ、多様な解析対象とできる血球系細胞であるCEMやBLCL（Bリンパ芽球）を選択した。樹立した細胞表面のMHC-I分子発現は特異的抗体を用いて免疫蛍光染色を行い、フローサイトメトリーにて確認した。対応するウイルスタンパク発現ベクターとして、代表者の近年の報告を踏まえVif発現ベクターを作製した。樹立したMHC-I分子発現細胞株にベクターを用いてウイルスタンパクを発現させ、同時に発現するレポーターによってフローサイトメトリーで発現を確認し、今後の基礎となる実験系の構築を得た。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度の計画は、MHC-I分子発現細胞株の樹立とウイルスタンパク発現ベクターの構築を行うことであり、この計画に則り最初にMHC-I分子発現ベクターを構築した。まずは細胞株として血球系であるCEM、BLCL（Bリンパ芽球）を用いることに決定し、発現ベクターを用いて目的のMHC-I分子を恒常的に発現する細胞株の樹立を開始した。抗生物質耐性を用いた選択により目的のMHC-I分子を発現する細胞を得た。MHC-I分子の発現量は特異的抗体を用いて免疫蛍光染色を行い、フローサイトメトリーで確認したが、このときCEMに関しては発現量の十分な細胞を得ることが困難であり、再作製を複数回行うことが必要となった。しかし本段階を経て最終的に樹立は奏功し、ウイルスタンパク発現ベクターとして主たる解析ツールであるVif発現ベクターも別途完成したため、本研究の現在までの進捗状況としてはおおむね順調に進展していると評価できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は計画通り、（１）エピトープ特異的CTLクローンの樹立と標的細胞との共培養で得られる反応の解析、（２）宿主因子発現がウイルス抗原提示に及ぼす影響の解析、（３）宿主因子によるウイルス抗原提示への作用機序の解明、と進めていく。（１）、（２）、（３）すべてに関して、本年度樹立した細胞に本年度完成させたウイルスタンパク発現ベクターを用いて作製する標的細胞を使用することが出来る。（１）のCTLクローン樹立や（２）で行う予定の宿主因子ノックダウンについては、本年度に習得した細胞樹立の手技を生かして手早く行うことを目標とする。CTLと標的細胞との共培養実験において標的細胞のキリング効率の差が検出できなかった場合には、本年度行ったMHC-I分子発現細胞株の樹立をまた別の細胞株について実行し、標的細胞の最適化を行う。またはウイルスタンパク発現ベクターのレポーターの最適化を行うなどして問題に対応する予定である。
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| Causes of Carryover |
本年度は、MHC-I分子発現細胞株の樹立とウイルスタンパク発現ベクターの構築を行った。まずMHC-I分子発現ベクターを構築し、これを用いて目的のMHC-I分子を恒常的に発現する細胞株を樹立した。使用する細胞株として、発現している宿主因子の種類と量をあらかじめ文献で調べ、血球系細胞であるBLCLとCEMを選択したが、より多様な解析を行うためには付着細胞であるHeLaについても樹立を行いたい。十分な発現量で目的のMHC-I分子を発現するCEMの樹立には何度かやり直しを要し想定より時間がかかったため、HeLaの樹立については次年度への持ち越しとなった。次年度使用額はこの目的を達成するために用いる計画である。
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