2019 Fiscal Year Research-status Report
mRNA搭載ナノキャリアを用いたパーキンソン病モデルのドパミン神経再生治療研究
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18K15378
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| Research Institution | Fukuoka University |
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Principal Investigator |
貴田 浩志 福岡大学, 医学部, 助教 (80529454)
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2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | パーキンソン病 / mRNA / 遺伝子導入 / 直接分化誘導 / ウルトラファインバブル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度に引き続き、先行研究を参考にin vitroでドパミン作動性神経への分化誘導実験を行った。複数の遺伝子の組み合わせでpAsp[DET]、pAsp[TET]、pAsp[TEP]などの高分子ミセルキャリアおよび市販のリポフェクション用製剤に搭載したmRNA遺伝子導入による分化誘導実験を行った。mRNAは目的の遺伝子のオープンリーディングフレームを組み込んだプラスミドベクターを鋳型として、内製および外注による受託で合成した。初代培養アストロサイトおよび、自然不死化アストロサイト細胞株を用いた。培養メディウムおよびサプリメントの最適化を行ったことで、細胞障害が軽減され、細胞生存率の改善は見られたものの、免疫染色でドパミン作動性神経神経マーカーの発現は得られず、いまだドパミン作動性神経の分化誘導系は確立されていない。遺伝子の組み合わせ、発現の強度、タイミングと持続時間の問題が考えられるため、次年度以降も継続してそれらの条件検討が必要な状態である。副次的な成果としてin vitroでキャリアを用いず、ウルトラファインバブルと超音波照射を用いて遺伝子導入を行う実験法の開発に成功した。市販の超音波造影剤から分離したウルトラファインバブルおよび、ヒトアルブミン溶解液を用いて、内製したウルトラファインバブルを用いて、アストロサイト細胞株に対し、ルシフェラーゼ遺伝子の導入を行い、その発現を確認できた。現時点ではpDNAの導入であるが将来的にはキャリアを用いず、物理的手法によりmRNAを導入する方法の開発につながることが期待される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初の目的であるmRNA投与によるドパミン作動性神経の直接分化誘導系の確立まで至らなかった。pDNAと比較して、遺伝子の発現強度と持続時間が不十分であることが原因として考えられる。遺伝子の発現強度をより高めるため、mRNAの導入量等の調節が必要である。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き、種々のmRNAの組み合わせの最適化を行うとともに、濃度調節などで、遺伝子発現強度と持続時間の最適化も行う。副次的に開発された、ウルトラファインバブルを用いた遺伝子導入法も組み合わせて、最適な遺伝子導入法の確立を目指す。それらの成果を用いて、モデルマウスを用いた治療実験を進める。
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| Causes of Carryover |
必要な試薬の購入時期が次年度以降になったため、差額が生じた。さらに追加して分化誘導因子の遺伝子を組み込んだプラスミドなどの合成が必要であり、次年度使用額を使用する予定である。
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