2020 Fiscal Year Annual Research Report
Construction of human artificial chromosome with animal-free chromosome engineering technology
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18K15671
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| Research Institution | Tokyo University of Pharmacy and Life Science |
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Principal Investigator |
宇野 愛海 東京薬科大学, 生命科学部, 助教 (30733357)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ヒト人工染色体 / ゲノム編集 / 遺伝子導入ベクター / 微小核細胞融合法 / HAC / iPS細胞 / 再生医療 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
testAnimal-free HACを構築するため、Chr.21qの遺伝子領域34Mb削除法の検討を行った。昨年度の結果を受けて、ヒトiPS細胞(hiPSC)内(hiPSC)内において、Chr.21qのセントロメア近傍及び、テロメア近傍を標的とするCRISPR/Cas9のRNA/タンパク複合体(RNP)による削除法を試みた。しかしながら、hiMSCにおいて使用したgRNA標的配列を用いたRNPでは、導入後48時間後の細胞集団においては、想定される削除を示すPCR解析結果を得られたものの、一細胞由来のChr.21q切除クローンを樹立することはできなかった。原因として、削除効率が非常に低いからであると推察された。このことから、当初計画通り、Cre-loxPシステム及び、薬剤選抜マーカー再構築系による削除クローンの選抜法を用いたChr.21q切除法へと計画を変更した。Chr.21qのセントロメア近傍、及び、テロメア近傍を切断可能なRNPは上述の結果から得られたため、このRNPを用いて、テロメア側にmCherry-loxJTZ17-NeoR、セントロメア側にEF1promoter-loxJT15-EGFPを順次挿入したクローンを獲得した。FISH解析により、目的箇所に上述ベクターが組み込まれたことを確認した。今後は、Cre発現により、loxJT15-loxJTZ17間の組換えを誘導し、NeoRが再構築されることからG418選抜を行い、目的に沿ったCrh.21q切除染色体を保持するクローンを獲得できるかを検証する。さらに、獲得されたChr.21q切除染色体に対して、同様の戦略により、Chr.21p領域の削除を試みることで、Animal-free HAC構築法の確立を目指す。
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Research Products
(1 results)
