2021 Fiscal Year Annual Research Report
The role of Connexin43 in bone cell communication and bone metabolisms
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18K17096
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
藤井 政樹 東京医科歯科大学, 歯学部, 非常勤講師 (30710024)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | コネキシン43 / 骨組織再生 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度Cx43の骨での役割を明らかにすべく、Cx43f/f, osx-cre+マウスを用いて４ヶ月齢でのCx43の組織特異的KOを誘導した。しかし、Cx43遺伝子KOの誘導を大腿骨でのCx43遺伝子発現を調べたところ、Cx43遺伝子発現に有意な低下が認められなかった。このことからCx43KO時期についての再考が迫られた。Cx43遺伝子のKOを経時的に確認する必要もあり、少し研究方針の転換をすることとした。最近注目を浴びている近接標識法を用いて、RANKLとRANKの結合を同時に見るような実験系を立ち上げている。ビオチン化酵素のTurboIDは近接する10nm範囲のタンパクをビオチン化する。このTurboIDをN末部分とC末部分に分けたものをRANKとRANKL遺伝子の前後にノックインし融合タンパクとしてそれぞれ発現させ、RANK-RANKL結合部位をin vivoで特定しようとするものである。さらに、RANKLにはTagを付け組織染色を可能にすることで、Cx43cKOの確認を容易にできるよう設計した。RANKL-TurboID-CとRANK-TurboID-NをRAW 細胞とHeLa細胞に恒常的に発現させた。この2種類の細胞を共培養することによりRAW細胞の破骨細胞分化とHeLa細胞のビオチン化の検討を行なった。ビオチンとATP存在下で共培養した結果のHeLa細胞タンパクのビオチン化は共培養の時間依存的に増加したが、RAW細胞の破骨細胞分化は認められなかった。現在はRANKLとTurboID-Cの間にリンカーを挿入することにより改善される可能性を考え実験を行なっている。現在行っているin vitroの実験でRANK-RANKLの結合および機能が確認され次第、マウス遺伝子へのノックインのためのベクターを構築し、Crispr/Cas9法による遺伝子改変マウスを作成予定である。
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