2018 Fiscal Year Research-status Report

メタボローム解析に用いる糞便の最適な採取・保存方法の検討と網羅的な代謝産物の測定

Research Project

Project/Area Number	18K17956
Research Institution	Tokyo University of Agriculture
Principal Investigator	盛喜久江東京農業大学, 応用生物科学部, 助教 (10805956)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2022-03-31
Keywords	代謝産物 / 胆汁酸 / 短鎖脂肪酸 / 糞便 / 精度管理
Outline of Annual Research Achievements	腸内細菌は食事によりダイナミックにその組成が変化することから環境因子の一つとして捉えることができ、肥満・2型糖尿病をはじめとする生活習慣病やアレルギー性疾患発症の原因として考えられている。この発症メカニズムの一つとして、腸内細菌によって食事由来物質などが代謝されて産生される代謝産物が大変注目されている。従って血漿中および糞便中の代謝産物を測定することが疾患の発症メカニズムの解明に必須と考えられるが、糞便中には夾雑物が多く、また代謝産物は温度や湿度などの外部環境の影響を受けやすいため、サンプルの採取方法、保存方法、抽出方法、の仕方は非常に重要である。そこで糞便の採取方法・保存方法による代謝産物への影響を検討し的確な精度管理方法を樹立することを目的とした。糞便中における代謝産物の測定については一般化された最適な方法が確立されておらず、これまでに多くの糞便中の代謝産物について報告されているが、サンプルの採取方法、保存方法、抽出方法は一定でないため、研究チームによって測定結果が異なっている可能性がある。そこで本研究では採取方法や保存方法が代謝産物の種類やその濃度に与える影響を検討し、糞便中の代謝産物の測定において的確な精度管理方法を行うこととした。さらに網羅的かつ感度良く測定する方法を樹立するために、一斉に脂肪酸や胆汁酸などの代謝産物をLC-MS/MS（LCMS8030, Shimadzu）やGC-MS（GCMSTQ8040, Shimadzu）を用いて測定する方法を検討した。当該年度は初年度のため、測定系の立ち上げと並行して、ヒトの糞便のサンプル収集を行った。測定系については、糞便中の胆汁酸はLC-MS/MSを用い、糞便中の短鎖脂肪酸はGC-MS/MSで測定ができるようになった。胆汁酸については更なる精度が求められるが短鎖脂肪酸は多検体を測定できるまでに至った。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 糞便中の胆汁酸18種類はLC-MS/MSを用いての測定方法を確立させることができた。短鎖脂肪酸10種類（Formate, Acetate, Propionate, Isobutyrate, Butyrate, Isovalerate, Valerate(Pentanoate), Hexanoate, Lactate, Succinate）はGC-MS/MSでの測定方法を確立し、一度に短鎖脂肪酸10種類を300検体以上測定できる測定系を立ち上げることができた。糞便の測定において的確な精度管理を行うために、採取位置や常温暴露時間、保存温度や凍結融解有無による代謝産物への影響を検討した。採取後30分以内に-80℃で保存したものをコントロールとして、各条件と比較し代謝産物の数や種類がどのように変化するのかを検討した。しかし、サンプルが目標数集まらなかったため、採取位置や保存温度による影響の傾向は検討できなかった。次年度では、サンプルを10例集め分析まで行う。
Strategy for Future Research Activity	サンプルをさらに多く集めるために、今年度は収集方法を改良し10例のサンプル収集を目指す。その際には倫理面にも十分配慮する。糞便中の胆汁酸18種類（コール酸、タウロコール酸、グリココール酸、リトコール酸、タウロリトコール酸、グリコリトコール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロケノデオキシコール酸、タウロヒオデオキシコール酸、タウロウルソデオキシコール酸、グリコデオキシコール酸、グリコケノデオキシコール酸、グリコヒオデオキシコール酸、グリコウルソデオキシコール酸）の測定系を立ち上げられたが、さらに多くの種類を同時に測定することを目指す。標準物質および適切な内部標準物質の検討を行い、さらなる測定精度の向上を目指す。
Causes of Carryover	初年度にて標準品や試薬等をすべて購入予定としていたが、研究の進行が遅れていたため購入できなかった。次年度では、さらに測定数を増やすので標準品や内部標準の購入および、サンプル収集のために必要な物品に使用する。