2018 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of the amyloid formation mechanism of cytochrome c using the laser trapping method
| Project/Area Number |
18K19146
|
|---|
| Research Institution | Nara Institute of Science and Technology |
|---|
Principal Investigator |
廣田 俊 奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 教授 (90283457)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2018-06-29 – 2021-03-31
|
| Keywords | タンパク質 / レーザートラッピング法 / 光圧 / アミロイド線維 / ドメインスワッピング / ジスルフィド結合 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
シトクロムcのヘム鉄に配位しているMet80と同じループ領域に含まれるAla83をCysに置換したA83C変異体と、C末端のGlu104をCysに置換したE104C変異体を作製した。各変異体をイオン交換カラムクロマトグラフィー及びゲルろ過クロマトグラフィーにより精製した後、挿入したCysを介して各変異体を分子間ジスルフィド架橋し、2量体を作製した。各変異体の2量体ではCys近傍の構造が固定化されるため、これらの領域の柔軟性がアミロイド線維形成に及ぼす影響が特定できる。波長1064 nmの連続波レーザーを用いたレーザートラッピング法により、分子間ジスルフィド架橋されたE104C 2量体のアミロイド線維形成を調べた。対物レンズでレーザー光をE104C 2量体を含む重水溶液中に集光すると、集光点に直径約4 μm の凝集体が形成されることが顕微鏡観察により判明した。この現象は、ドメインスワッピングした野生型シトクロムcの2量体のレーザートラッピングの結果と類似していた。光圧により生成したE104C変異体の凝集体にレーザー光を照射し続けると、直径約2 μmの凝集体の中心部分の透過率が減少した。その後、凝集体の中心部分は直径1 μm程度に収縮するとともに、共存させたチオフラビンTによる蛍光強度が著しく増大した。さらに、集光点を移動することによりE104C変異体の凝集体を連続的に作製し、凝集体を超音波処理によってほどいた後、透過型電子顕微鏡で観察したところ、幅数nmのアミロイド線維が集まって幅数十nmのバンドル構造を形成していた。以上より、シトクロムcのE104C変異体の分子間ジスルフィド架橋2量体は光圧によってアミロイド線維化し、Glu104周りの構造を固定化しても、アミロイド線維が形成されることが分かった。これらの情報はシトクロムcのアミロイド線維形成機構の解明に有用である。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
シトクロムcのA83C変異体とE104C変異体を作製した。各変異体を精製後、各変異体を分子間ジスルフィド架橋し、2量体を作製した。E104C 2量体のレーザートラッピング法による顕微鏡観察、共存チオフラビンTの蛍光観察、さらに凝集体の透過型電子顕微鏡を行うことができた。
|
| Strategy for Future Research Activity |
A83C変異体 2量体のレーザートラッピング法による顕微鏡観察、共存チオフラビンTの蛍光観察、凝集体の透過型電子顕微鏡を行う。さらに、得られたデータをもとに、シトクロムcのアミロイド線維形成に重要な部位を特定する。
|
| Causes of Carryover |
ジスルフィド結合で架橋したシトクロムc変異体の2量体の作製と精製法を確立するのに時間を要したため。
新しいシトクロムc変異体の2量体のアミロイド形成挙動を調べるため、タンパク質の作製や精製、レーザーラッピング法などの消耗品費として使用する。
|
