2019 Fiscal Year Research-status Report

植物細胞で機能するエフェクター様因子探索を目的とした希少さび病菌遺伝子情報の収集

Research Project

Project/Area Number	18K19206
Research Institution	Yokohama National University
Principal Investigator	平塚和之横浜国立大学, 大学院環境情報研究院, 教授 (30202279)
Project Period (FY)	2018-06-29 – 2021-03-31
Keywords	植物病原菌 / さび病菌 / エフェクター / 一過性発現 / NGS解析
Outline of Annual Research Achievements	本年度は菌体の確保については順当に実施でき、当初の予定通りにメダケ赤衣病菌（Stereostratum corticioides)の冬胞子の集塊を十分量収集することが出来た。また、DNA回収と精製については、さらに試行を重ね、40kb以上の長鎖DNAを選択的に得られる方法を模索しているが、これまで用いてきた手法では、ホモジナイザーによる強い剪断力と、ガラス面への吸着が問題となっていた。そこで、今年度はシリコン処理したスライドガラスに挟み込んで穏やかに潰す方法について検討した。その結果、プロテイナーゼK処理などを加えることで、ある程度長鎖のDNA抽出・精製の目途が立った。しかし、作業効率は必ずしも良好とは言えず、さらなる試行錯誤は避けられないと思われた。従って、状況によっては長鎖DNA試料が得られない場合でも、そのままNGS解析に進むことを判断する必要が有るとも考えられた。一方、アグロバクテリウムを用いた一過性発現系によるハイスループット系について検討し、96穴プレートのみで無く、384穴プレートを用いた実験系についても検討した。具体的には、シロイヌナズナの芽生えに対して、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターを連結したイントロン導入ルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現させるコンストラクトを導入したアグロバクテリアを共存培養し、発現レベルの斉一性等について条件検討を行った。その結果、384穴プレートを用いた場合でも、ほぼ斉一な一過性遺伝子導入発現が可能と思われる知見が得られた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 集中的に実施する予定であったNGS解析の外注が遅れ、新型コロナウイルスによる想定外の状況で実験が十分に実施出来なかったことが原因である。
Strategy for Future Research Activity	1年間の延長により、新サンプルの確保が可能となったので、実験が実施出来ない状況ではあっても、新鮮なさび病菌試料の確保等を実施し、実験開始に備える。
Causes of Carryover	DNA精製に慎重を期し、年度末まで伸ばしていたところに新型コロナウイルスの影響が重なり、当該年度において計画どおりにNGS解析を実施出来なかった。次年度においては、実験の実施が可能となるタイミングでNGS解析を行い、先送りとなってしまった外国出張を実施する。