2019 Fiscal Year Research-status Report
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18K19305
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| Research Institution | Yokohama City University |
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Principal Investigator |
緒方 一博 横浜市立大学, 医学研究科, 教授 (90260330)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
仙石 徹 横浜市立大学, 医学部, 講師 (60576312)
浜田 恵輔 横浜市立大学, 医学部, 助教 (00344052)
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| Project Period (FY) |
2018-06-29 – 2021-03-31
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| Keywords | 転写制御 / 転写因子 / ヌクレオソーム / エンハンソソーム / 定量解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
転写因子は遺伝子の転写制御において中心的な役割を果たすが、転写因子のエンハンサーへの作用機序については未だに不明な点が多く残されている。例えば、ゲノムDNAは単なるDNAとしてではなく、転写因子のDNA結合を阻害するヌクレオソームとして存在するが、ヌクレオソームに対して、転写因子群がどのようにして特異的な結合サイトを探し当て、結合し、転写を制御するのか、その素過程の理解は十分とはいえない。これまでの解析から、転写因子群のヌクレオソームへの結合には、ヒストン修飾酵素、クロマチンリモデリング因子、ヒストンシャペロン等のタンパク質群や、それらによって引き起こされるヒストン修飾が必要であることが想定されている。本研究では、これらの因子がどのように協調してヌクレオソーム状態のエンハンサーDNAに作用して転写を活性化するのか、その詳細な過程を生化学的な再構成実験により明らかにすることを目的とする。
実験内容として、まず蛍光標識した180bpからなるT細胞抗原受容体（TCRα）のエンハンサーDNAを含むヌクレオソームを調製して、個別に精製したRunx1やEts1等のTCRαエンハンサーを標的とする転写因子群と相互作用するか検証した。その結果、これら転写因子は、ヌクレオソームDNA上の標的配列が末端側に配置されたヌクレオソームに対して結合活性を示したものの、標的配列に変異導入したヌクレオソームに対しても同程度結合したことから非特異的なヌクレオソーム結合であることが示唆された。これらの結果よりヌクレオソームからエンハンソソームへの変換は、転写因子のみでは進展せず、別の因子の関与が示唆された。今後、ヒストン修飾酵素、クロマチンリモデリング因子、及びヒストンシャペロン等の共存下で、転写因子群とヌクレオソームの結合条件の解析を行い、ヌクレオソームDNA上にエンハンソソームが形成される過程を検証する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
実験試料の準備として、転写因子群やヒストン修飾酵素に加え、転写因子の標的配列を有するTCRαエンハンサーDNA（180bp）を蛍光標識し、それを含むヌクレオソームを塩透析法により調製した。また、実験の陽性コントロールとして転写因子Oct3/4及びSox2の標的遺伝子の一つであるLIN28BエンハンサーDNA（162bp）を含むヌクレオソームも同様に調製した。機能解析として、TCRαエンハンサーDNAを含むヌクレオソームに対して転写因子Runx1、Ets1、CBFβ、LEF1、及びCREBを様々な濃度で加えることで、転写因子群によるヌクレオソームへの特異的な結合をゲルシフトアッセイにより検証した。その結果、これら転写因子は、ヌクレオソームDNA上の標的配列が末端側に配置されたヌクレオソームに対して結合活性を示したものの、標的配列に変異導入したヌクレオソームに対しても野生型と同程度の結合活性を示したことから、両者の結合は非特異的相互作用によるものと考えられた。同様に、陽性コントロールとして準備したLin28BエンハンサーDNAを含むヌクレオソーム対しても、過去の報告に反して転写因子Oct1やSox2による特異的な結合は検出されなかった。これらの解析から、ヌクレオソームからエンハンソソームへの変換は、ヌクレオソーム中に存在する転写因子の標的配列のポジショニング、あるいは、転写因子のヌクレオソームへの結合を促進する別の因子の関与が示唆された。
ヌクレオソームと様々な因子との相互作用を構造生物学的に理解するため、クライオ電子顕微鏡を用いた単粒子解析に着手した。長いリンカーDNAを持つヌクレオソームと修飾酵素との複合体サンプルを調製して画像収集を行ったところ、修飾因子由来の密度を再構成像に確認することができた。今後、サンプル調製条件と解析法を最適化し、複合体の構造決定を目指す。
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| Strategy for Future Research Activity |
１）転写因子のヌクレオソームへの結合はヌクレオソーム中に存在する標的配列の向きや位置にも依存することが考えられるため、転写因子の標的配列を様々な位置に導入したヌクレオソームの調製を行い、転写因子とヌクレオソームの相互作用の検討を行う。
２）これまで転写因子群とヌクレオソームとの結合の解離定数をゲルシフトアッセイにより半定量的に解析してきたが、本研究ではMicroscale Thermophoresis装置（NanoTemper Monolith）を用いて定量解析を行う。予備的な測定では、試料によってはシグナルの不安定化により測定が困難であった。反応液の組成などの実験条件を改善して、様々な組み合わせの転写因子とヌクレオソーム間の解離定数を解析する。
３）TCRα、及びLIN28BのエンハンサーDNAを含むヌクレオソームを再構築し、個別に精製した転写因子群、ヒストンアセチル化酵素p300、ヒストンメチル化酵素NSD2、クロマチンリモデリング因子ACF、ヒストンシャペロンNap1等を様々な組み合わせで作用させ、ヌクレオソームへの転写因子群の結合状態やヒストン修飾状態を解析する。さらに、予め酵素的にアセチル化やメチル化したヌクレオソームを調製し、転写因子群に対する反応の違いを検証する。活性型のヒストン修飾酵素は調製済みである。これらの解析から、ヌクレオソームDNA上に複数の転写因子群からなるエンハンソソームが形成される過程、あるいは、ヌクレオソームからヒストンを競合的に追い出すために必要な因子は何か明らかにする。
４）上記の生化学的解析を通じてエンハンソソーム形成過程の中間状態を同定したのち、それらの立体構造をクライオ電顕顕微鏡により解析する。
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| Causes of Carryover |
本研究はヌクレオソームに対して、精製した転写因子群、ヒストンアセチル化酵素p300などのヒストン修飾酵素、ヒストンシャペロンなどを様々な組み合わせで作用させ、ヌクレオソームの解体に必要な因子を同定することを目指す。しかしながら、実験の準備段階でヌクレオソームの再構築、転写因子Oct4、及び活性型p300の調製に時間を要した為、研究の進展が遅れ、それに伴い予算配分の再検討が必要となった。
次年度では、タンパク質発現用の真核細胞培地、蛍光標識したDNAオリゴマー、MST測定用試薬等を発注する予定である。
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[Journal Article] The recurrent postzygotic pathogenic variant p.Glu47Lys in RHOA causes a novel recognizable neuroectodermal phenotype2019
Author(s)
Yigit G, Saida K, DeMarzo D, Miyake N, Fujita A, Yang Tan T, White SM, Wadley A, Toliat MR, Motameny S, Franitza M, Stutterd CA, Chong PF, Kira R, Sengoku T, Ogata K, Guillen Sacoto MJ, Fresen C, Beck BB, Nurnberg P, Dieterich C, Wollnik B, Matsumoto N, Altmuller J
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Journal Title
Human Mutation
Volume: 41
Pages: 591～599
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Ataxic phenotype with altered CaV3.1 channel property in a mouse model for spinocerebellar ataxia 422019
Author(s)
Hashiguchi S, Doi H, Kunii M, Nakamura Y, Shimuta M, Suzuki E, Koyano S, Okubo M, Kishida H, Shiina M, Ogata K, Hirashima F, Inoue Y, Kubota S, Hayashi N, Nakamura H, Takahashi K, Katsumoto A, Tada M, Tanaka K, Sasaoka T, Miyatake S, Miyake N, Saitsu H, Sato N, et al.,
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Journal Title
Neurobiology of Disease
Volume: 130
Pages: 104516～104516
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Genetic landscape of Rett syndrome-like phenotypes revealed by whole exome sequencing2019
Author(s)
Iwama K, Mizuguchi T, Takeshita E, Nakagawa E, Okazaki T, Nomura Y, Iijima Y, Kajiura I, Sugai K, Saito T, Sasaki M, Yuge K, Saikusa T, Okamoto N, Takahashi S, Amamoto M, Tomita I, Kumada S, Anzai Y, Hoshino K, Fattal-Valevski A, Shiroma N, Ohfu M, Moroto M, Tanda K, Nakagawa T, Sakakibara T, Nabatame S, et al.,
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Journal Title
Journal of Medical Genetics
Volume: 56
Pages: 396～407
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Germline-Derived Gain-of-Function Variants of Gsα-Coding GNAS Gene Identified in Nephrogenic Syndrome of Inappropriate Antidiuresis2019
Author(s)
Miyado M, Fukami M, Takada S, Terao M, Nakabayashi K, Hata K, Matsubara Y, Tanaka Y, Sasaki G, Nagasaki K, Shiina M, Ogata K, Masunaga Y, Saitsu H, Ogata T
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Journal Title
Journal of the American Society of Nephrology
Volume: 30
Pages: 877～889
DOI
Peer Reviewed
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