2018 Fiscal Year Research-status Report
高速大規模な画像情報の取得を特徴としたゲノムプロフィリングシステムの開発と応用
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18K19839
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
保川 清 京都大学, 農学研究科, 教授 (30397559)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
ビヤニ マニッシュ 北陸先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 客員教授 (00599780)
吉高 淳夫 北陸先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 准教授 (60263729)
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| Project Period (FY) |
2018-06-29 – 2021-03-31
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| Keywords | ゲノムプロフィリング / PCR / 温度勾配ゲル電気泳動 / 画像処理 / 変曲点 / データベース |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、「ハードウエアの開発」、「ソフトウエアの開発」、「ハードとソフトの融合」に分けて進めている。
・ハードウエアの開発：本項目では、細菌・細胞の培養、DNA抽出、DNA増幅をMMVマイクロアレイで行い、その後、サンプルをゲルに移してTGGEを行う一連の操作を自動化し、手作業が基本的に不要なシステム「MMV-TGGEシステム」の開発を目的としている。2018年度は、5サンプルを同時に泳動できるTGGEシステムを設計した。現在、（株）ピーエムティーに試作を依頼する方向で進めている。
・ソフトウエアの開発：本項目では、TGGEの泳動パターンを追跡し、変曲点を求める手法を開発することを目的としている。2018年度は、ある点における濃度値とその点が右方向に関して上下どの向きに進行しているかを判定し、順次一つの連続した線として保持し、線幅の情報を確定させることをめざした。そのために、各軌跡に対して、シグモイド関数のパラメータを変更しつつ、フィッティングに関する評価関数の値を求め、評価関数の幅により、軌跡を推定する処理を組み込むことに取り組んだ。
・ハードとソフトの融合：本項目では、各種用途に対してそれぞれ複数の測定項目を設定し、対応するプライマーを設計し、配列解析も同時に行い、TGGEの泳動パターンと関連づけ、「革新GPデータベース」を構築することを目的としている。2018年度は、等温DNA増幅法であるRPA（Recombinase Polymerase Amplification）法の基本性能を確認した。また、RPA法を構成する3種類の酵素であるリコンビナーゼ（recA）、1本鎖DNA結合タンパク質（SSB）、DNAポリメラーゼについて大腸菌で組換え酵素を発現させた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
・ハードウエアの開発（主担当：ビヤニ）： 今回設計した5サンプルを同時に泳動できるシステムでは、温度勾配を横軸方向に1回だけである。MMVマイクロアレイでのPCRについては、温度変化が速やかに伝わるよう、MMVマイクロアレイのサーマルサイクラーへの設置方法について種々の検討を行った。
・ソフトウエアの開発（主担当：吉高）：1ピクセルよりは大きな斑点状の領域（人の判断としては点状に見えるもの）が複数ピクセルから構成されるため、アルゴリズム的にはピクセルを複数回にわたって追跡してしまっていることについて、線長に関する制約を導入することで、これらの線領域をすべて削除することで対応した。また、京都大学でTGGEを行い、目視で変曲点を求める作業を行っている担当者と議論し、多くのTGGEパターンを入手した。
・ハードとソフトの融合（主担当：保川）：嘔吐型セレウス菌の毒素であるセレウリドを合成する酵素の遺伝子であるcesDをモデルとしてRPA法の性能を検討した。感度はPCRとほぼ同等であった。反応温度は34℃～46℃の範囲であり、増幅に要する時間は5分間であったことから、PCRに対する優位性が確認された。
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| Strategy for Future Research Activity |
・ハードウエアの開発：1024ウエルのMMVチップからのサンプルをハンドリングできる100ウエルのMMVチップ（ウエルのサイズは縦横1.6 mm、深さ1 mm）を設計する。MMVチップの作製には3Dプリンター（Ultimaker 3, Netherlands）を用いる。まず、0.4 mmあるいは0.25 mmのノズルを用いて、縦横0.5 mm、深さ1 mmのウエルをプリントする。チップが十分平らであるか、でこぼこがないかについて、注意を払う。3Dプリントの各種パラメーター（Layer height, Infill, Top/bottom thickness, Line width, Infill speed, Wall line count, Wall speed, Top/bottom speed, Travel speed, Print acceleration, Travel acceleration, Printing temperature, Retraction distance）を最適化する。マイクロTGGEについては、まず、従来の装置を用いて、2サンプルを泳動する。今後、そのためのチップを作製する。
・ソフトウエアの開発：一つ一つの軌跡に対して、シグモイド関数のパラメーターを変更しつつ、フィッティングに関する評価関数の値を求め、その値により軌跡を推定する処理を組み込む。基本的なアイデアは、ハフ変換で使用する関数をシグモイド関数としたものである。
・ハードとソフトの融合：2018年度はTwist社から販売されているキットを用いてRPAの評価を行った。今後は、自家製造した酵素を用いてRPAを実現させ、各種評価を行う。また、「革新GPデータベース」の構築に向けて、配列既知の複数のPCR増幅断片に対してTGGEを行い、配列の違いが変曲点に与える影響について解析する。
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| Causes of Carryover |
MMVマイクレアアレイの設計に時間がかかり、3DプリンターによるMMVチップの作成の一部を2019年度に行うことになった。ただし、全体計画に大きな影響はない。
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[Journal Article] Construction and characterization of ribonuclease H2 knockout NIH3T32019
Author(s)
Tsukiashi, M., Baba, M., Kojima, K., Himeda, K., Teisuke T., and Yasukawa, K.
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Journal Title
The Journal of Biochemistry
Volume: 165
Pages: 249-256
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Accurate fidelity analysis of the reverse transcriptase by a modified next-generation sequencing2018
Author(s)
165.Okano, H., Baba, M., Hidese, R., Iida, K., Li, T., Kojima, K., Takita, T., Yanagihara, I., Fujiwara, S., and Yasukawa, K.
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Journal Title
Enzyme Microbial Technology
Volume: 115
Pages: 81-85
DOI
Peer Reviewed
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