2007 Fiscal Year Annual Research Report
新規血管保護因子-分泌型RAGEの発現機構と病態整理の解明
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19390085
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
山本 博 Kanazawa University, 医学系研究科, 教授 (00115198)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
渡辺 琢夫 金沢大学, 医学系研究科, 准教授 (40303268)
浅野 雅秀 金沢大学, 学際科学実験センター, 教授 (50251450)
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| Keywords | RAGE / esRAGE / alternative splicing |
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| Research Abstract |
分泌型RAGEの各種病態における役割および分泌型RAGE生成にいたる選択的スプライシングの制御機構を明らかにすることを目的とし、研究実施計画に基づいて研究を遂行した結果、以下の成果を得た。1.分泌型RAGE過剰発現マウスの作製
マウスアルブミン遺伝子のプロモニターの下流にヒト分泌型RAGE cDNAをつないだ融合遺伝子を作製し、マウス受精卵雄性前核にマイクロインジェクション後、受精卵を仮親に移植して分泌型RAGE過剰発現マウスのラインを作製した。
2.分泌型RAGE欠損マウス(膜型RAGE cDNAノックインマウス)の作製
マウスRAGE遺伝子のすべてのエクソンとイントロンを含む領域を膜型RAGEのcDNA配列によって置換し、両端にloxP認識配列を持つネオマイシン耐性カセットをその下流に挿入したターゲティングベクターを作製した。
3.選択的スプライシング機構の解明
a.CMVプロモーターの下流にEGFPおよびRAGE遺伝子のエクソン8以降の配列を融合させたミニ遺伝子発現ベクターを作製し、293T細胞株に一過性に導入した。
b.上記のミニ遺伝子由来の膜型および分泌型に対応するスプライシング産物を、mRNAレベルでは共通塩基配列部分のプライマーを用いたRT-PCR法により、タンパクレベルでは共通タグであるEGFPに対するウェスタンブロット法によりの識別・定量し、それらの生成比を検討した。その結果、このミニ遺伝子が内在性RAGE遺伝子産物の選択的スプライシングをよく再現することが明らかになった。
c.上記のミニ遺伝子に種々の変異を挿入し、選択的スプライシングに対する影響を検討した。その結果、選択的スプラインク制御している可能性のある復数のシス配列が同定された.
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