棘皮動物由来ホスホリパーゼA2の立体構造と基質特異性の関係

2007 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19580230
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 岸村 栄毅 Hokkaido University, 大学院・水産科学研究院, 准教授 (50204855)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 関崎 春雄 北海道医療大学, 薬学部, 教授 (50094834) ; 豊田 栄子 北海道医療大学, 薬学部, 教授 (00103200) ; 居弥口 大介 北海道医療大学, 薬学部, 助教 (00433425)
• Keywords: 棘皮動物 / ヒトデ / 酵素 / ホスホリパーゼA2 / リン脂質 / 基質極性基特異性 / 立体構造 / X線結晶構造解析

Research Abstract

イトマキヒトデの幽門盲のうホスホリパーゼA_2(PLA_2,EC3.1.1.4)は市販ブタ膵臓PLA_2と比較して約30倍高い陽イオン性基質分解活性を示し、特徴的な基質極性基特異性を有する。本年度は1.イトマキヒトデPLA_2の遺伝子構造の解明のためにmRNAの未知塩基配列決定を行った。また、2.立体構造の解明のために酵素の結晶化を試みた。
1.イトマキヒトデPLA_2mRNAの未知塩基配列を決定し、ポリA鎖、シグナルペプチドおよびプロ配列を解明した。その結果、611bpの3'-UTR、60bpのプレプロ領域、および215bpの5'-UTR塩基配列を決定し、ポリA鎖およびポリAシグナルの存在、17残基のシグナルペプチド配列および3残基のプロ配列が明らかになった。これらのことから、イトマキヒトデ幽門盲のうPLA_2はイトマキヒトデの細胞内で発現し、シグナルペプチドを切断して細胞外に分泌され、プロ配列を切断して活性型のPLA_2になると考えられた。
2.イトマキヒトデPLA_2の結晶化にあたって、標準酵素として卵白リゾチームおよび海産生物由来酵素としてカタクチイワシ内臓由来トリプシンの結晶化も同時に行うことにより結晶化の条件検討を行った。その結果、卵白リゾチームおよびカタクチイワシ内臓由来トリプシン・アイソザイムIの結晶化に成功した。同様の条件によりイトマキヒトデPLA_2の結晶化を試みたところ、小さな結晶は得られたが、X線結晶構造解析に十分な大きさの結晶を得る事ができなかった。