2021 Fiscal Year Annual Research Report
Structural Dynamics of Nitric Oxide Reductases Srudied by Time-Resolved Techniques
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19H00926
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| Research Institution | University of Hyogo |
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Principal Investigator |
城 宜嗣 兵庫県立大学, 理学研究科, 教授 (70183051)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 一酸化窒素還元酵素 / 脱窒 / 嫌気呼吸 / 髄膜炎菌 / クライオ電子顕微鏡 / 時間分解構造解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
バクテリアの一酸化窒素還元酵素はヘム鉄と非ヘム鉄よりなる複核錯体を反応中心として、以下の酵素班のを触媒する：2NO + 2H+ + 2e- --> N2O + H2O。緑膿菌の一酸化窒素還元酵素（cNOR）と髄膜炎菌の一酸化窒素還元酵素（qNOR）を研究対象とした。一昨年度には、cNORの酵素反応は２つの短寿命反応中間体を生成をふくむ三段階の素反応で進む事を明らかにした。時間分解赤外分光法とクライオアニーリングESR法によって、第一反応中間体（マイクロ秒の寿命）は、一分子のNOが非ヘム鉄に配位した状態であると提案した。その配位構造をさらに詳細に決定するために、時間分解X線結晶構造解析を試みることとし、その準備実験を行った。酸素バリアフィルムを用いた酸素非存在下での、反応中心の鉄が還元された状態での結晶化と結晶状態での酵素反応の観測に成功した。第二反応中間体（数ミリ秒の寿命）を電子状態と配位構造を詳細に検討するために、プロトン供給経路を遮断した変異体を調製した。この変異体は第二反応中間体の反応性の低下によって酵素活性が大きく減少した。現在、クライオアニーリング法を用いた解析を行っている。
qNORは、結晶構造解析よりも低温電子顕微鏡に適した酵素である事を昨年度までに明らかにした。そこで、この方法を用いてqNORの二量体と単量体の構造解析に成功した。両者の構造比較から、二量体が単量体よりも活性が高い原因が、プロトン供給経路の安定化によるものと結論できた。阻害剤による酵素反応阻害の機構を明らかにする目的で、阻害剤結合型のqNORの構造を解析中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
cNORの第一反応中間体の解析は、ほぼ終了した。その時間分解構造解析は挑戦的要素が強く、手法の開発を模索しながらの進展となる。第二反応中間体はその構造・電子状態は、時間分解可視吸収スペクトルの測定から予測はできているが、未だに決定的な実験的証拠は得られていない。プロトン輸送遮断の変異体を用いた実験に期待している。
qNORは、低温電子顕微鏡による構造解析に適した試料であることから、非常に順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
cNORの第一および第二反応中間体の詳細な解析は続ける。また、亜硝酸還元酵素NiRの存在した状態での反応解析もおこなう。
qNORは病原菌がマクロファージの放出する抗菌ガスNOの無毒化に機能していることから、その阻害剤は抗菌薬のターゲットとなる。化合部バンクを用いたスクリーニングにより、抗菌薬候補となる化合物を選択する。その化合部とqNORとの複合体の構造解析により、阻害メカニズムの詳細を議論する。
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Research Products
(12 results)
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[Journal Article] Coordination and Electronic Structures of Short-Lived Intermediate in NO Reduction by Cytochrome P450 NO Reductase as Characterized by Time-Resolved IR Spectroscopy and XFEL Crystallography2021
Author(s)
T. Nomura, T. Kimura, Y. Kanematsu, K. Yamashita, K. Hirata, G. Ueno, H. Murakami, T. Hisano, R. Yamagiwa, H. Takeda, C. Gopalasingam, Y. Kino, R. Kousaka, S. Yanagisawa, O. Shoji, T. Kumasaka, Y. Takano, H. Ago, M. Yamamoto, H. Sugimoto, T. Tosha, M. Kubo, Y. Shiro
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Journal Title
Proc. Natl. Acd. Sci. USA
Volume: 118
Pages: e2101481118
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] XFEL Crystal Structures of Peroxidase Compound II2021
Author(s)
H. Kwon, J. Basran, C. Pathak, M. Hussain, S. Freeman, A. Fielding, A. Bailey, N. Stefanou, H. Sparkes, T. Tosha, K. Yamashita, K. Hirata, H. Murakami, G. Ueno, H. Ago, K. Tono, M. Yamamoto, H. Sawai, Y. Shiro, H. Sugimoto, E. Raven, P. Moody
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Journal Title
Angew. Chem. Int. Ed. Engl.
Volume: 60
Pages: 14578-14585
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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