2019 Fiscal Year Annual Research Report
Structural basis of reaction mechanism and proton pathway of [NiFe]-hydrogenase
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19H00984
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| Research Institution | University of Hyogo |
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Principal Investigator |
樋口 芳樹 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 教授 (90183574)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | ヒドロゲナーゼ / 中性子結晶解析 / X線結晶解析 / プロトン経路 / ラマン分光法 / 活性測定法 / 酸素耐性酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本課題では以下の（１）～（３）について研究を推進した．
（1）[NiFe]ヒドロゲナーゼの高分解能中性子結晶構造化学：酵素を水素分子で活性化してプロトン経路をH+でラベルした条件の結晶について高分解能の中性子回折データを取得し，プロトン経路を同定することを目標とした．硫酸還元菌由来の[NiFe]ヒドロゲナーゼの水素還元型巨大単結晶を調製し，日本原子力開発研究機構・大強度陽子加速器施設（J-PARC）にて中性子回折テスト実験を行い高分解の中性子回折データを収集可能な単結晶であることを確認した，現在，本測定待ちの状態である．
（2）ヒドロゲナーゼの酸素耐性機構・一般則の確立（分子内の水分子の役割解明）： 2019年度は，Ni-Fe活性部位最近接部位に[4Fe-4S]-4Cys方のクラスターをもつ酸素耐性のCitrobacter由来[NiFe]ヒドロゲナーゼについて，競争阻害剤である一酸化炭素（CO）を結合させた結晶試料の高分解能X線解析を進展させることを目標とした．一般に，酸素耐性酵素にCOは結合しないが，本酵素はCOが結合すると報告されている．従って，CO結合時の酵素分子内の水分子の構造変化を調査することを目的としている．本酵素のCO結合型溶液試料のEPRスペクトルを塩基性pH条件下で測定し，pH9近傍の溶液（結晶化条件）でもCOが結合していることをうかがわせるデータの取得に成功した．現在，結晶化を進めている．
（3）ラマン分光法による触媒活性定量法の開発： 再現性の高いラマン散乱データを得るために2019年度は，専用の測定セルを考案し，作成した．そのセルを用いてテストデータを測定中である．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
最も困難を予想していた，課題１の水素還元型酵素の中性子結晶解析用の巨大単結晶の調製に成功し，現在，フルデータセットの測定待ちの状態である．既に酸化型結晶の中性子結晶構造は得られているため，現在進行中の水素還元型結晶の中性子結晶構造が得られれば，本課題の最も重要な部分が達成できる．
また，課題２では，CO結合型結晶調製のための条件検討が終わった．
課題３では，測定セルの開発が順調である．
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| Strategy for Future Research Activity |
2020年度は各課題について以下のように推進していく．
（1）[NiFe]ヒドロゲナーゼの高分解能中性子結晶構造化学： 2019年度に調製に成功した硫酸還元菌由来の[NiFe]ヒドロゲナーゼの水素還元型巨大単結晶について，日本原子力開発研究機構・大強度陽子加速器施設（J-PARC）にて中性子回折実験を行い高分解の中性子回折フルデータセットを収集する．次に同じ結晶について，SPring-8にて高分解能X線回折データを収集する．中性子とX線の回折データを用いて高精度の中性子結晶解析を進める．
（2）ヒドロゲナーゼの酸素耐性機構・一般則の確立（分子内の水分子の役割解明）： 2019年度に分光学的手法で決めたCitrobacter由来[NiFe]ヒドロゲナーゼのCO結合型試料の調製条件下における結晶化を進め，SPring-8で超高分解のX線回折データの取得を目指す．また，CO結合型溶液試料のFT-IR分光法による測定を進める．
（3）ラマン分光法による触媒活性定量法の開発： 2019年度に作成した専用の測定セルを用いて様々な条件で硫酸還元菌由来の[NiFe]ヒドロゲナーゼの酵素活性を測定する．
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