2020 Fiscal Year Annual Research Report
Elucidation of mechanotransduction mechanisms with visualization of molecules
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19H01020
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
渡邊 直樹 京都大学, 生命科学研究科, 教授 (80303816)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | メカノトランスダクション / 細胞接着 / アクチン流動 / 超解像顕微鏡 / 単分子イメージング / 分子標的薬 / キナーゼ阻害薬 / Src |
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| Outline of Annual Research Achievements |
生体は様々な物理ストレスに曝される。本研究では、細胞にかかる力学作用と生体構造の変換制御の関わりの解明を目標に、eSiMS単分子イメージング法および超解像顕微鏡IRISといった独自の細胞内分子可視化技術を発展・応用させる。IRISは、既存の超解像顕微鏡を超えた忠実な描写と無制限の多重染色を実現するが、個々の分子に対する検出プローブの開発が必要となる。この問題の解決のため、IRISに必要な解離速度の速いモノクローナル抗体をハイスループットでスクリーニングする系を樹立し報告した。加えて本論文では、力学センサーの１つである内耳有毛細胞の不動毛にあるアクチン束の構造変換解析への応用例も示した。また、細胞は、外部環境の力学的性質を接着分子を介し感知し、移動・増殖・分化するが、この力の伝播や役割を解明するためにインテグリン・ビンキュリン・タリンを含む複数の接着分子の動態とアクチン線維流動との比較をeSiMSを用い進めた。細胞内構造の流動と接着分子系との接点における「ずり応力」に関する新知見を得つつある。関連して、接着依存性細胞増殖シグナルにも関与が知られるチロシンキナーゼSrcが、悪性疾患の治療薬として用いられている複数のキナーゼ阻害薬によって、接着斑に移動し基質であるFAKと結合することを見出し報告した。重要なことに、SRC遺伝子に阻害薬抵抗性変異がはいると阻害薬の早期解離が起き、結合するFAKをリン酸化することに引き続き、Grb2のリクルートメントおよびErkの活性化が起き、細胞増殖の促進につながることも見出した。分子標的薬が場合によっては標的を逆に活性化し、がん細胞の増殖を促進する逆説的阻害薬作用を示唆する重要な所見である。ヒト臨床おける意義や、外部環境とがんの進展との関連におけるキナーゼ阻害薬の新たな副作用の可能性について、今後深く探求することが重要と考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2020年度は、その前年度末の2月後半頃からCovid-19の影響で実験機器（特に光学系）・一部試薬の納入時期が不安定となる状況に陥り、6月頃までその影響を強く受けた。そのため、19年度末に一部研究費を繰り越すとともに、遠隔会議によるミーティングを主とした活動に制限するなどの対策を施す必要が生じ、研究の進捗に少なからぬ影響があった。しかし、その後はほぼ通常どおりに研究活動を行うことができた。一部の学会活動や学内での教育活動への対応に時間を取られることがあったものの、本年度において、IRIS用プローブのモノクローナル抗体をベースとした迅速製造法についてのものと、悪性腫瘍の分子標的薬であるキナーゼ阻害薬が逆説的に標的キナーゼとその下流のシグナルを活性化、がん細胞の増殖を促進する新規の薬剤副作用の分子メカニズムについて、主要な国際誌に論文としてまとめ、成果を発表することができた。現在でも、光学機器の機器選定や納入に際して、部品不足や輸送上の問題のため時間がかかるなど制限が残っているものの、研究活動の大筋については平常に近いペースで行えるようになった。ほぼ予定どおり、成果につなげていると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
初年度に、可動性基質（PDMS）上の細胞に外部からの牽引力を加える手法を樹立し、ラメリポディア先端のアクチンが「重合センサー」をして働くことを報告した。この系を発展させ、細胞基質の変型度合い・向き・周期を精密にコントロールする工夫を加えることで、フォルミンファミリーによるアクチン重合核形成の活性化、接着分子の動態と力学作用の性質がどのようにリンクするかの検証を進める。上皮や血管内皮細胞で形成されたシートや３次元培養でのスフェロイド・初期胚の底部における観察にも挑む。加えて、確立ずみの赤外蛍光一分子観察も取り入れ、培養系の深部における単分子イメージングも遂行する予定である。細胞頂部にかかるずり応力の作用については、脈動を押さえた灌流システム構築に成功している。これらで得られた知見に基づき、多ウェル培養プレートでのハイスループットの力学作用評価系の構築を目指す。上記とは別に、アクチン流動に引きずられ接着斑に通常局在する接着分子が同じ速度で流動する現象を捉えつつある。また、接着斑周囲でアクチン線維の配向性の変化を可視化することに成功し、その力学的な制御を示唆する知見を得つつある。高輝度蛍光アクチンの高精度分子トラッキング技術を応用し、力の伝播様式やその役割について解析を進めるとともに、国際共同研究で取り組んでいる数理モデルとの比較を行う予定である。超解像顕微鏡IRISについては、多種の細胞構造の可視化に向けた条件検討、プローブ開発を進めている。前年度に報告したプローブのさらなる改良や新規のプローブ開発について、成果報告の準備を進めるとともに、力学作用の細胞構造への影響の解明を目指す本研究への応用にも取り組む。
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Research Products
(8 results)
