2021 Fiscal Year Annual Research Report
Global impact of marine secondary chloroplast estimated from the function of diatom pyrenoid.
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19H01153
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| Research Institution | Kwansei Gakuin University |
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Principal Investigator |
松田 祐介 関西学院大学, 生命環境学部, 教授 (30291975)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田中 厚子 琉球大学, 理学部, 助教 (40509999)
原田 尚志 鳥取大学, 工学研究科, 准教授 (50640900)
嶋川 銀河 関西学院大学, 生命環境学部, 助教 (60853885)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 海洋性珪藻 / 二次葉緑体 / ピレノイド / 一次生産 / 光合成 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
地球一次生産に重要な海洋性珪藻類の葉緑体ピレノイド構造・機能およびその地球生態系への影響を定量する目的で、分子ツールが整備された二種、羽状目Phaeodactylum tricornutum（Pt）および中心目Thalassiosira pseudonana（Tp）を用いて研究をすすめた。
①これまでに同定した両珪藻の新奇ピレノイド構成成分Pyshell、Best、およびθ型炭酸脱水酵素（CA）について、これらの因子と相互作用するタンパク質を免疫沈降法と近接依存性ビオチン標識法によって、電気泳動レベルで確認した。その結果、Best因子との相互作用候補をタンパク質バンドとして確認した。また、Ptの新規のBest因子と考えられる遺伝子をさらに3つ確認した。②両珪藻におけるこれら因子の局在を、GFPタギングにより確認したところ、新しいPtBestの一つはピレノイド近傍に位置することが示された。また、免疫電子顕微鏡観察による確認の結果、TpθCA2がピレノイドチラコイド内腔に、またPtpyshellがピレノイド外縁部に局在が確認された。③CRISPR/Cas9ニッカーゼ法を本格的に運用し、TpBest1,2の同時破壊株、TpPyshellの破壊株を取得した。現在これらの株は高CO2要求性を示す表現型であることが分かってきている。④珪藻葉緑体構造・機能・動態の分子モデル化を本格的に進めている。Best因子群はピレノイドと連携しているものとピレノイドから離れているもので機能が分別されること、またPyshellはピレノイド構造の正確な維持と光合成機能に必須な因子である点をモデルとして組み込んでいる。⑤PyshellとθCAの海洋遺伝子動態ビッグデータの解析を行った結果、前者はストラメノパイル特異的で後者は海洋の主要CAであることが分かった。成果の一部を国際および国内学会で報告した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
①ピレノイド機能に関わると考えられるBestの相互作用因子と考えられるタンパク質の発見に成功した。なお、ピレノイドチラコイド内腔のθCAに対する相互作用因子は恐らくないことが示唆された。
②免疫電顕によってTpθCAがピレノイドチラコイド内腔にあることを電顕レベルで確認し、内腔型チラコイドの存在を完全に確認できた。また、Pyshellがメッシュ状の構造体としてピレノイドを覆っていることを強く示唆するデータを得た。
③ゲノム編集によって、TpPyshellおよびTpBest1,2の完全破壊株を単離することが出来た。これらは生育とCO2順化特性に野生型とは対照的な表現型を示し、今後の詳細な表現型解析でピレノイドの構造・機能モデルの重要なパーツが明確化されると確信できる状況となっている。
④相互作用因子の探索はゆっくりとした進行であるが、大きな骨格となるPyshell,BestおよびθCAのピレノイド構造・機能維持に関わるモデルは構築可能なレベルに来ている。
⑤これら重要ピレノイド因子の海洋メタゲノムデータベースでの解析が十分可能であること、θCAが主要な海洋CAであること、およびPyshell因子がCO2濃縮機構（CCM）に重要な因子であることが確認されている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の実験には、引き続き海洋性珪藻二種、P.tricornutumおよびT.pseudonanaを用いる。研究全体を、引き続き以下のサブプロジェクトに分け遂行する。
①2021年度は若干停滞気味であったが、これまでに発見したピレノイド因子に対する相互作用因子を、改良型近位依存性ビオチン標識法（TurboID法）を用いて芋づる式にリストアップをすすめる。適宜光アミノ酸（PAA）による化学架橋標識も使用する。また、各因子の抗体作製を進め、生化学的な解析系を充実させる。
②リストアップされた候補から二次葉緑体移行シグナル（ASAFAPモチーフ）を持つものを優先的に選抜し、これらの遺伝子を取得する。この遺伝子に蛍光タンパク質遺伝子或いは蛍光低分子標識用HALOタグ遺伝子等を融合し、多波長蛍光によって細胞内局在の関連確認を行う。また、透過型電子顕微鏡（TEM）を用いた免疫TEM観察を用いて、リストアップされた因子の局在を順次詳細に決定し、新奇ピレノイド因子群の局在決定を完了する。
③すでにCRSPR/Cas9ニッカーゼ法で破壊が完了したTpPyshell、TpBest1,2について、生育特性、葉緑体分裂とのかかわり、光合成パラメーターの詳細な解析を行い、これら重要ピレノイド因子の機能を決定する。PtPyshell、PtBest、ACCase、θ型炭酸脱水酵素の編集破壊株についても取得・解析を進め、構築モデルの珪藻での一般性を担保するデータセットを得る。
④葉緑体構造・機能・動態モデルの骨子を完成し、⑤海洋環境ゲノムデータを用いて、これら因子のグローバル分布を分析、モデルに基づいた機能を分析に挿入してグローバル機能分布のマッピングにつなげる。
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