2020 Fiscal Year Annual Research Report
Innovative gene/nucleic acid delivery system based on optimized intracellular trafficking steps
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19H01170
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
原島 秀吉 北海道大学, 薬学研究院, 教授 (00183567)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐藤 悠介 北海道大学, 薬学研究院, 助教 (10735624)
中村 孝司 北海道大学, 薬学研究院, 助教 (20604458)
山田 勇磨 北海道大学, 薬学研究院, 准教授 (60451431)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | siRNA / 細胞内局在 / がん免疫療法 / 脂質ナノ粒子 / ミトコンドリア / 核酸送達 / 遺伝子治療 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１ siRNA送達（佐藤）：siRNAの肝臓における細胞内局在（細胞質あるいは核）の経時的な変化を定量的RT-PCR法により定量的に測定する。また、局在化素子のsiRNAへのコンジュゲート法を確立し、前述の定量的細胞内局在測定法を用いて局在変化を評価する。細胞内局在と遺伝子ノックダウン活性との相関を解析する。
２ pDNA送達（原島）：肝臓選択的なキャリアと脾臓選択的なキャリアの体内分布を比較したところ、臓器移行量に大きな違いはなく、遺伝子発現の差はキャリアの臓器移行量では説明できないことが示された。核移行、転写、翻訳の各過程の効率を評価するため、組織からの核単離法の確立に着手した。ウェスタンブロッティング法により単離核中のタンパク質を評価したところ、核以外のオルガネラマーカーは検出されず、純度が高い核単離法であることが示唆された。
３ がん免疫ナノ療法（中村）：アジュバントと抗原を搭載したナノDDSを腫瘍内投与、皮下投与、静脈内投与することで、腫瘍、リンパ節、脾臓の標的化を行った結果、抗腫瘍活性に明確な差が認められた。また、主要組織におけるがん免疫関連遺伝子の発現変化の解析を開始し、T細胞応答の質的変化の可能性が示唆された。
４ ミトコンドリア (Mt)への送達(山田)： 2019年度に開発を進めた新型MITO-Porterを疾患細胞に添加し、細胞内動態を観察およびMt機能を評価する。細胞内動態観察は、共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いて観察しキャリアのMt送達効率の最適化をはかる。Mt機能は細胞外フラックスアナライザーを利用してMt酸素消費量を指標に評価する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１ siRNA送達（佐藤）：コンジュゲート化siRNAの脂質ナノ粒子化を行い、非コンジュゲート体と同等の最大遺伝子ノックダウン活性を示すことを明らかにした。投与早期における活性発現時間の違いに着目した解析中である。
２ pDNA送達（原島）：肝臓選択的なキャリアと脾臓選択的なキャリアの体内分布を比較したところ、臓器移行量に大きな違いはなく、遺伝子発現の差はキャリアの臓器移行量では説明できないことが示された。核移行、転写、翻訳の各過程の効率を評価するため、組織からの核単離法を確立した。
３ がん免疫ナノ療法（中村）：アジュバントと抗原を搭載したナノDDSを腫瘍内投与、皮下投与、静脈内投与することで、腫瘍、リンパ節、脾臓を標的化し、異なる抗腫瘍活性を示す系を見出すことに成功した。
４ ミトコンドリア (Mt)への送達(山田)： 疾患細胞Mtに核酸および遺伝子を送達可能なMITO-Porterの開発に成功し、治療核酸を送達時にMt機能を回復させることに成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
１ siRNA送達（佐藤）：siRNAにコンジュゲーションする細胞質局在化素子配列を変更したものを合成し、脂質ナノ粒子の物性、siRNAの細胞質局在、および遺伝子ノックダウン活性を指標に適切な配列を同定する。
２ pDNAの送達（原島）：取込以降の過程に着目し、遺伝子発現差の要因を探索する。タンパク質発現量、細胞内/核内のpDNA/mRNA量を測定し、核移行、転写、翻訳の各過程の効率を算出することで、寄与が大きい過程を識別する。核移行の寄与が大きい場合は、核輸送因子の結合を評価する。転写の寄与が大きい場合は、DNAの核内局在やメチル化状態を解析する。翻訳の寄与が大きい場合は、DNA導入に伴う各種細胞内センサー刺激の翻訳活性への影響を評価する。
３ がん免疫ナノ療法（中村）：アジュバントと抗原を搭載したナノDDSを腫瘍内投与、皮下投与、静脈内投与し、脾臓やリンパ節といったリンパ組織におけるT細胞応答をフローサイトメトリーにて細胞レベルで評価する。特に、T細胞の活性化フェノタイプに注目して解析を進める。そして、ナノDDSの体内動態、T細胞応答、抗腫瘍活性の関連性を明らかにする。
４ ミトコンドリア (Mt)への送達(山田)： 神経細胞および軸索輸送の検証が可能な神経組織に新型MITO-Porterを添加し、細胞内動態を観察およびMt機能を評価する。細胞内動態観察は、共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いて観察しキャリアのMt送達効率の最適化をはかる。
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| Remarks |
本取組では、血管の多様性の理解に基づいた診断薬と血管を標的とする組織選択的な核酸ナノ医療を統合することで、がん、メタボリック症候群、脳転移・脳神経疾患に対応した個別化ナノ医療の実現を最終目標として、北海道大学発、日本発の革新的医薬を創出、医療イノベーションと人類の健康に貢献するものである。
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